滴度及注射方式對2型腺相關病毒載體表達效果的影響

賈俊濤，王 昆，潘 登，李 強，杜晨光,*

(1．內蒙古農業大學 職業技術學院,內蒙古 包頭014109；2.河北省農林科學院 糧油作物研究所，河北 石家莊 050000;3.內蒙古農業大學 獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

對有關發育、學習、行為和能量調控等相關神經網絡的探索是生命科學的研究熱點之一，其相關問題可以通過對某個特定神經元或核團的人為干擾或研究某一分子在神經回路中的影響來得到一定的解答。高度特異性和高效的方法是支撐這些研究成功的基礎。腺病毒家族由不具有包膜的30～38 kb線性DNA組成[1]。根據其凝集特點可以將57個血清型分為A～G類[2]。由不同的血清型衍生而來的各種腺相關病毒載體(adeno-associated viral vector,AAV) 是一種可用于靶向和操縱神經系統內特定神經元亞型的強力工具[3]。在使用這種工具之前，有些問題應當重視，其包括但不僅限于：(1)如何運送AAV至指定區域；(2)使用何種基因調控元件；(3)選擇何種血清型[4]。研究表明，腦立體定位注射是運送AAV至指定神經元或核團的常用方式[5]；突觸啟動子(synapsin promoter)等強力啟動子則是增強AAV在中樞神經系統中轉導性的必備元件之一[6]；2型腺相關病毒載體(adeno-associated viral vector serotype 2,AAV2)因其神經元特異性，長期以來被用于神經系統的相關研究當中[7]。因此，在神經學研究中，選擇具有較強啟動子的AAV2運載外源基因、通過腦立體定位注射到指定核團則有利于試驗的順利進行。本試驗選擇AAV2-CMV-EGFP對照載體進行研究正是基于以上原因。

通過對外源的轉錄、翻譯，AAV可將特異神經元跨突觸信號傳遞情況直觀反映出來[8]。這樣的試驗結果大大方便了人們對不同神經核團之間信號傳導的研究(包括不同腦半球之間的信號溝通)，但也體現出另外一個問題：即如何保證外源基因隨載體進入目標神經元后的表達周期內，病毒不會因擴散至相鄰的神經核團帶來試驗數據的干擾？為了驗證這種情況是否存在，我們在考慮參考文獻[4]提出的3個基本問題的基礎上，利用對照試驗中常用的AAV2-CMV- EGFP(1.3×1011mg/L)對3周內病毒的擴散區域進行了檢測；同時，驗證了不同滴度和注射方式下，AAV能否在注射區域附近局限性表達，期望可以為AAV相關技術在獸醫研究應用中的普及提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物飼養試驗使用的小鼠為C57BL/6雄性小鼠(6周,20～23 g)，購自北京維通利華公司。小鼠飼養在12/12 h周期的環境下(光照時間為07：00至19：00)。按照《內蒙古大學實驗動物使用和護理指南》的道德標準進行試驗(批準號SYCK2014-002)。腦立體定位前2 h，移除小鼠的水和食物。

1.2 腺相關病毒載體腦立體定位注射選擇Dil Stain (D3911,ThermoFisher)用于確定注射位點。使用1%～3%異氟烷進行誘導麻醉，0.3%異氟烷用于呼吸麻醉的維持。呼吸后固定于全自動腦立體定位儀(Neurostar,StereoDrive-DM)，根據圖譜所示位置進行定位(stereotaxic coordinates of the mouse hypothalamus[9])。相應位置打孔后，利用微量注射器將AAV2-CMV-EGFP(HAV1001,漢恒生物)注射于RPa (from Lambda:anterior-posterior (AP):-2.2 mm,mediolateral(ML):+0.0 mm,dorsoventral(DV):-5.5 mm,圖1)、延髓中部(from Lambda:AP:-2.2 mm,ML:+0.0 mm,DV:-3.0 mm,圖2)。普通注射:0.25 μL/min注射4 min，停針2 min；壓力注射:以0.1 μL/min，注射10 min，停針10 min。無菌條件縫合傷口皮膚，術后注射40萬單位青霉素抗菌，單獨飼養3～4 d自愈。

1.3 測定EGFP熒光表達部位定位注射3周后，使用蠕動泵進行心肺灌注。預先使用預冷的生理鹽水灌注2 min,后轉為4%多聚甲醛(pH=7.4,Sigma-Aldrich)灌注20 min取材。4℃環境下使用4%多聚甲醛固定6 h，再用30%蔗糖進行脫水，直至沉降到試管底部。

使用冰凍切片機(Slee Medical,Germany)以20 μm 厚度進行連續切片，腦片按不同區域置于含0.01 mol/L PBS (pH 7.4)的12孔板。4℃環境下，使用飄片法(Free-floating)加入 0.4%TritonX-100(Sigma-Aldrich)于300 r/min恒溫孵育器(Eppendorf,ThermoMixerTMC)上清洗10 min。用1 mg/L DAPI(Sigma-Aldrich )進行核酸染色5 min。拍照使用Nikon C2 PLUS Confocal(Nikon，Japan) 成像系統在其對應的405 nm (DAPI)、488 nm (EGFP)、561 nm (Dil Stain)以及647 nm (檢測假陽性)波段下進行。

2 結果

2.1 高病毒滴度下的擴散情況為研究AAV在核團注射3周后的侵染效果，試驗首先選用1.3×1011mg/L 這一較高滴度進行試驗。結果顯示，經普通注射方式，該滴度雖然有效地在第3周時表達了病毒載體所攜帶的EGFP熒光蛋白基因，但并不局限于延髓RPa區域及臨近區域。在下丘腦室旁核(paraventricular nucleus,PVN) 區域及其周圍，較多的特異性熒光信號被發現(圖1)。同樣，這種廣泛的表達情況也存在于四腦室周圍的孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)區域(圖1)。延髓中縫蒼白核 (raphe pallidus nucleus,RPa)區域及其周圍相較于前腦PVN區域，可見更為清晰的熒光信號(圖1)。

這一結果顯示了AAV在1.3×1011mg/L 滴度下可有效在3周內由延髓RPa區域侵染至前腦PVN區域，這達到了利用腺病毒進行遠距離跨神經元示蹤的要求。但是，同樣也提出了另外一個問題，如果要使用腺病毒進行中樞神經系統的局部基因敲除或特定區域的激活、上調，這種大范圍、多核團的外源基因表達結果顯然不符合試驗設計的要求。

AⅠ.下丘腦PVN及其周邊區域熒光表達狀況；AⅡ.下丘腦PVN陰性結果；BⅠ.NTS區域熒光表達狀況；BⅡ.NTS區域陰性結果；CⅠ.RPa區域熒光表達狀況；CⅡ.RPa陰性結果

2.2 低滴度下2種不同腦立體定位注射方式的對比除降低注射滴度外，注射方式可能也會影響到AAV表達情況。為了盡可能將病毒載體局限于某個神經核團周圍，較低劑量的AAV(1.3×108mg/L)被注射在延髓區域(圖2A)。當以0.25 μL/min速度注射4 min、停針2 min的普通注射方式進行定位注射后，AAV在第3周的表達較弱、熒光值相對較低，難以與熒光背景進行區分(圖2B)。當以0.1 μL/min速度注射10 min、停針10 min的壓力注射方式進行定位注射后，AAV在第3周的表達狀況得到了一定的好轉，熒光信號更加清晰(圖2C)。結果表明，采用0.1 μL/min速度注射10 min，停針10 min 的方式進行注射，相比較之前的試驗結果(圖1)，腺病毒在腦內的表達范圍被明顯限制(圖2D～F)。

2.3 病毒載體EGFP表達結果及其非特異性熒光情況在使用較低滴度(1.3×108mg/L) 和壓力注射等方式后，可將病毒在3周內的侵染范圍限制在局部區域(圖3)并獲得較好的熒光蛋白表達結果。此外，在使用EGFP(488 nm波長激發)具有較清晰結果的掃描參數進行成像的過程中，637 nm 激光通道未見明顯的非特異性熒光信號。由于AAV的熒光信號常與其他通道信號共同使用以表明病毒的工作狀態(如敲除，或特異性神經元調控)。因此，這一結果預示在AAV和其他波段熒光信號共表達的試驗設計中，使用低滴度、壓力注射的方式對獲得清晰可靠的試驗結果具有一定的積極作用。

3 討論

目前，AAV配合Cre-Loxp重組系統在神經元的在體功能研究中被廣泛應用。利用以Cre-Loxp為首的重組系統發展而來的DREADDs技術可通過Gq、Gi和Gs(如hM3Dq、hM4Di和GsD)信號傳導途徑，在體內環境下，對多種細胞進行中遠程和非侵入性控制，達到激活、抑制和調節GPCR信號傳導途徑以及神經傳遞的目的[10-11]。而AAV依靠其安全性高、侵染性強、表達穩定等特點為這一技術的推廣做出了巨大貢獻。如若由此進一步思考，那么保證AVV有效侵染和表達的區域集中于目標核團就成為了利用DREADDs對特定神經元調控成功與否的關鍵。

本試驗結果表明，病毒在高濃度情況下，其3周的擴散范圍幾乎可以從延髓區域擴散至前腦下丘腦區域。這樣的擴散速率和覆蓋范圍顯然有利于使用AAV對特定神經元進行全腦的定位，為研究特定的神經通路和神經連接提供幫助[12]。但是，如果試驗目的定位在特定神經核團，如標定和激活弓狀核(arcuate nucleus,ARC)區域的刺鼠相關蛋白(agouti-related peptide,AgRP)神經元[13]，那么限制病毒在注射核團周圍就成為了數據是否穩定的關鍵。

A.注射部位(DAPI藍色，Dil 綠色)；B.0.25 μL/min速度注射4 min，停針2 min方式注射3周后結果；C.0.1 μL/min速度注射10 min，停針15 min方式注射3周后結果；D.壓力注射3周后PVN區域EGFP熒光表達；E.壓力注射3周后注射區域附近EGFP熒光表達；F.壓力注射3周后RPa區域EGFP熒光表達

A．病毒載體注射3周后，EGPF表達狀況；B.488 nm激光激發下EGFP的局部表達；C.637 nm激光激發下病毒載體非特異性熒光狀況

本試驗中，采用降低病毒滴度和采用壓力注射的方式來限制病毒的擴散范圍和確保病毒載體的高效表達。當病毒滴度降為1.3×108mg/L時，病毒的擴散范圍和表達效果受到了一定的減弱(圖2B)，但是這種表達因其外源基因表達量較低，難以充分發揮出腺病毒高表達效率的特點。因此，在進一步的試驗中，采用了壓力注射的方式，期望以較低的注射速度和較長的停留時間使得注射部位可以有較多的病毒載體存在。相比普通核團注射方式，這種注射方式可以使得病毒載體的表達效果得到一定的提升，并且病毒載體在3周后的擴散范圍也基本停留在注射核團附近。因此初步認定，降低病毒滴度至1.3×108mg/L并配合壓力注射的方式，可以使得AAV所攜帶的外源基因在延髓具有高表達和區域性的特點。此外，鑒于AAV中的EGFP基因在應用過程中存在一定的假陽性問題，且高滴度下尤為明顯[14]，我們在488 nm和647 nm激發波長下使用相同的成像參數進行了掃描，結果顯示在得到較好的外源基因表達結果的參數下，647 nm激發波長下的熒光結果(相比488 nm激發波長)沒有出現明顯的假陽性現象。

綜上所述，在AAV有效性得到保障、外源基因片段對載體干擾性較小的情況下，選擇較低滴度的腺病毒(1.3×108mg/L)并結合壓力注射的方式可以在一定程度上保證外源基因的高效和區域性表達，且沒有明顯的假陽性現象。