弗里熊蜂蜜罐中糖液成分分析

蘇 睿,秦加敏,董 坤,宋文菲,賈紅偉,3,梁 鋮,*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661100;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),昆明 650201;3.紅河學(xué)院,云南蒙自 661100)

昆蟲(chóng)綱(Insecta)膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)的物種，主要以花蜜和花粉為食物(吳燕如,2000)。其中以蜜蜂屬Apis的物種最為典型，能夠?qū)⒉杉幕蹘Щ爻矁?nèi)貯藏，進(jìn)而釀造成蜂蜜，這一生物學(xué)行為有效保留了食物營(yíng)養(yǎng)，防止變質(zhì)，是其適應(yīng)自然而進(jìn)化出的重要生存策略(匡邦郁和匡海鷗,2003)。蜜蜂釀造蜂蜜是一段復(fù)雜的生物、化學(xué)和物理變化過(guò)程。蜜蜂在花蜜中添加生物酶，同時(shí)脫去多余的水分，在這一過(guò)程中花蜜中的蔗糖被生物酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，與花蜜相比，蜂蜜含水量降低，pH值和化學(xué)組成發(fā)生了改變，含有更多的生物活性物質(zhì)，如蜂王漿主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)、氨基酸和酶(Lichtenberg-Kraag,2014;Eyeretal.,2016;Zhangetal.,2019)。目前在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分超過(guò)180種，且大部分都是在蜂蜜釀造過(guò)程中產(chǎn)生的(Lichtenberg-Kraag,2014)。研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜中的化學(xué)組分與蜜蜂在采集花蜜和蜂蜜釀造過(guò)程中添加的酶有關(guān)，蜜蜂添加到蜂蜜中的生物酶是由其咽下腺和唾液腺產(chǎn)生的，其中最重要的酶包括淀粉酶(α-淀粉酶)、轉(zhuǎn)化酶(α-葡萄糖苷酶)和葡萄糖氧化酶，而添加的量及酶的活性取決于很多因素，如工蜂的日齡、飼料、蜜蜂的生理狀態(tài)、蜂群的強(qiáng)弱、溫度以及蜂群的進(jìn)蜜量(Al-Sherifetal.,2017)。因此，不同蜂蜜中酶的活力存在很大差異。最近的研究報(bào)道了西方蜜蜂Apismellifera和東方蜜蜂Apiscerana釀造的蜂蜜中特異性蛋白質(zhì)電泳條帶差異很大，且這種差異只與蜂種有關(guān)(Zhangetal.,2019)，表明不同蜂種釀造的蜂蜜成分存在一定差異。

熊蜂屬Bombus是蜜蜂科(Apidae)中的重要類群。目前全世界發(fā)現(xiàn)有熊蜂250種(Cameronetal.,2007)，中國(guó)有125種(黃家興和安建東,2018)，其中云南分布有36種(梁鋮等,2018)。熊蜂是眾多野生植物和農(nóng)作物的重要傳粉昆蟲(chóng)(王曉峰等,2013;Ahmadetal.,2015;Sherry and Strang,2015;Zhangetal.,2015;Sapiretal.,2019)，特別是對(duì)高山、高原植物及一些瀕危植物的傳粉具有重要作用(Kudoetal.,2011;Pradervandetal.,2014)，在維系植物區(qū)系、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定，以及促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用。熊蜂具有與蜜蜂相似的覓食生物學(xué)，但因其群勢(shì)小，貯藏在蜜罐中的花蜜較少，目前有關(guān)熊蜂釀蜜生物學(xué)方面的研究鮮有報(bào)道。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式和種植結(jié)構(gòu)的改變，繁育熊蜂為農(nóng)作物授粉具有巨大的市場(chǎng)需求。國(guó)外已有多個(gè)熊蜂物種被人工馴化，用于設(shè)施農(nóng)業(yè)授粉(Velthuis and Doorn,2006)。然而，目前中國(guó)對(duì)本土熊蜂的繁育和授粉應(yīng)用尚處于發(fā)展階段，市場(chǎng)上用于農(nóng)作物授粉的熊蜂以歐洲地熊蜂Bombusterrestris為主。采用外來(lái)蜂種授粉，存在物種入侵帶來(lái)的生態(tài)危機(jī)。據(jù)報(bào)道，外來(lái)蜂種授粉時(shí)與本土熊蜂搶奪食物資源和營(yíng)巢場(chǎng)所，干擾生殖，傳播病蟲(chóng)害，引發(fā)本土傳粉蜂數(shù)量和分布區(qū)域縮減等潛在影響(Inoueetal.,2008;張?bào)w銀等,2015;袁曉龍等,2018)。因此，加強(qiáng)對(duì)本土熊蜂的基礎(chǔ)研究迫在眉睫。

弗里熊蜂Bombusfriseanus是云南優(yōu)勢(shì)物種，廣泛分布于海拔1 200-4 400 m的山地，是多種植物的泛化傳粉者(梁鋮等,2018)。近年來(lái)其周年繁育技術(shù)已在國(guó)內(nèi)獲得成功，使得利用弗里熊蜂B.friseanus為農(nóng)作物授粉成為可能(Liangetal.,2020)。在人工繁育研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)弗里熊蜂B.friseanus會(huì)在蜜罐中存儲(chǔ)糖液，這為本研究提供了基礎(chǔ)。研究本土熊蜂的釀蜜生物學(xué)，了解其采集食物貯藏的特性和自身生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需求，對(duì)科學(xué)配制人工飼料，奠定規(guī)模化繁育的基礎(chǔ)，保護(hù)本土熊蜂的物種多樣性具有重要意義。本研究利用白砂糖溶液飼喂弗里熊蜂B.friseanus，收集并檢測(cè)了其貯藏在蜜罐中糖液的理化和生化指標(biāo)，旨在解析熊蜂對(duì)其采集的食物是否具有釀造能力，為熊蜂生物學(xué)和繁育研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試蜂群：本實(shí)驗(yàn)分別于2018和2019年的7-9月進(jìn)行。弗里熊蜂B.friseanus由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)授粉蜂研究實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)蜂群放置于同一間暗室內(nèi)飼養(yǎng)，暗室內(nèi)溫度28±1℃，相對(duì)濕度60%±5%，蜂群9群，蜂王正常產(chǎn)卵，每群工蜂數(shù)量約60頭。

1.1.2設(shè)備與試劑：酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-RAD xMarkTM)、電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器有限公司)、數(shù)顯折射儀(ATAGO，Brix 0%～53%和58%～90%)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、α-淀粉酶試劑盒(Solarbio)、DNS試劑(Solarbio)、精密pH試紙(0.5-14)，氯化鈉、乙酸鈉、冰乙酸均為分析純，標(biāo)準(zhǔn)品果糖(C6H12O6)、葡萄糖(C6H12O6)、蔗糖(C12H22O11)、麥芽糖(C12H22O11·H2O)和海藻糖(C12H22O11·2H2O)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品制備

準(zhǔn)確稱取500 g食品級(jí)一級(jí)白砂糖，加入500 g無(wú)菌純凈水，攪拌溶解煮沸，待冷卻后，用無(wú)菌純凈水定量至1 000 g，配制成50%的糖溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，4℃保存?zhèn)溆谩Ｌ幚斫M實(shí)驗(yàn)樣品的采集在飼養(yǎng)熊蜂的暗室內(nèi)完成。預(yù)先用滅菌吸管移出實(shí)驗(yàn)蜂群蜜罐中的原有糖液，移走飼喂瓶饑餓處理3 h，而后將配制好的50%的糖溶液放入滅菌飼喂瓶?jī)?nèi)，飼喂實(shí)驗(yàn)蜂群直至采樣。同時(shí)用相同配方的花粉飼喂蜂群以滿足幼蟲(chóng)發(fā)育所需的蛋白質(zhì)(蜂群中有大量幼蟲(chóng)存在時(shí)工蜂才會(huì)積極貯藏糖液)。24 h后用無(wú)菌吸管吸取工蜂貯藏在蜜罐中的糖液(圖1)，放入1.5 mL離心管。每次取樣時(shí)每群熊蜂單獨(dú)使用一支新的滅菌吸管，并且取完蜜罐中的所有糖液。每次采樣時(shí)移走飼喂瓶停止飼喂，以免蜜罐中可能混入熊蜂剛剛貯藏的糖液，樣品采集完成后再飼喂蜂群直至下一次采樣。分別間隔1,2,3,4,5,6和7 d，歷時(shí)28 d收集7組樣品。同時(shí)在1.5 mL滅菌離心管中盛放上述50%的糖溶液，放置在同一蜂箱中，排除熊蜂取食，作為對(duì)照組。采集好的樣品放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 弗里熊蜂的蜂巢及其貯藏的糖液Fig.1 Comb and sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus

1.3 pH值和總糖濃度檢測(cè)

用1 mL吸管取1滴樣品滴至pH試紙上，檢測(cè)樣品的pH值。用數(shù)顯折射儀測(cè)定總糖濃度。

1.4 糖組分檢測(cè)

處理組和對(duì)照組樣品中糖種類及含量委托中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所分析測(cè)試中心進(jìn)行檢測(cè)。以果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和海藻糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。色譜條件如下：Agilent 1100，配置蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD；色譜柱：Waster Carbohydrate Analysis Column,4.6 mm×250 mm，4 μm；流動(dòng)相：乙腈∶水(75∶25,v/v)等梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；蒸發(fā)溫度：80℃；霧化溫度：60℃；載氣：氮?dú)猓魉?1.7 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。以質(zhì)量體積比濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定樣品中糖的種類，以外標(biāo)法計(jì)算糖的含量。

1.5 α-淀粉酶活性檢測(cè)

采用試劑盒檢測(cè)α-淀粉酶活性。α-淀粉酶活性單位定義為：每g樣品每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 mg還原糖為1個(gè)酶活力單位(U/g FW)。預(yù)先配制pH 5.30的乙酸鈉緩沖液：稱取8.70 g乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)、1.45 g氯化鈉，加蒸餾水充分溶解，冰乙酸調(diào)節(jié)pH，定容至50 mL。稱取0.01 g樣品，加入0.5 mL乙酸鈉緩沖液，蒸餾水定容至10 mL，室溫靜置10 min，充分提取，稀釋1倍即為待測(cè)樣品原液。測(cè)定步驟依α-淀粉酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。

1.6 轉(zhuǎn)化酶活性檢測(cè)

以0.1 g/mL的蔗糖溶液為轉(zhuǎn)化酶底物，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照張忠義等(2002)研究方法并改進(jìn)。首先配制pH 4.60的HAc-NaAc緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?00 mg葡萄糖，蒸餾水稀釋成1,0.5,0.25,0.125,0.0625和0.03125 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩７Q取0.05 g樣品加入5 mL HAc-NaAc緩沖液，室溫靜置10 min，充分提取，蒸餾水定容至100 mL，制成待測(cè)樣品原液。

分別設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對(duì)照管和測(cè)定管，測(cè)定步驟如下：①向6支標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入75 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白管中加75 μL蒸餾水；②對(duì)照管和測(cè)定管中分別加入75 μL待測(cè)樣品原液，并將其與蔗糖溶液置于45℃水浴10 min；③對(duì)照管中加入150 μL DNS試劑，其余管中分別加入75 μL蔗糖溶液，45℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min；④對(duì)照管中加入75 μL蒸餾水，其余各管分別加入150 μL DNS試劑，90℃水浴10 min終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定A540。轉(zhuǎn)化酶活性單位定義為：每g樣品每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 mg還原糖為1個(gè)酶活力單位(U/g FW)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用Excel 2010和SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)。采用one-way ANOVA方差分析，用LSD多重比較法分析不同貯藏天數(shù)樣品中濃度、糖組分、pH和兩種酶活性的差異顯著性，顯著或極顯著水平分別設(shè)為P<0.05或P<0.01；采用t檢驗(yàn)分析貯藏在蜜罐中的糖液和對(duì)照組糖液的pH差異顯著性；采用二元變量的Pearson系數(shù)分析糖組分含量與蔗糖或貯藏時(shí)間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同時(shí)間的糖液pH值和濃度

熊蜂貯藏在蜜罐中1～7 d的糖液pH值平均為3.74±0.13(n=28)，t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其極顯著低于對(duì)照組(6.55±0.15,n=28,P<0.01)，表明糖液經(jīng)熊蜂貯藏后pH顯著降低。糖液在蜜罐中貯藏1～7 d后，濃度由50.00%升高到61.20%～81.10%，平均濃度75.07%±5.29%(n=126)。單因素方差分析結(jié)果表明，貯藏6 d的平均糖濃度為78.43%±1.81%，與貯藏4,5和7 d時(shí)的糖濃度差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于貯藏1,2和3 d時(shí)的濃度(P<0.05)(圖2)；Pearson相關(guān)性分析表明，濃度與貯藏時(shí)間顯著正相關(guān)(Pearsonr=0.40,P<0.01,n=126)，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)濃度升高。

2.2 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同時(shí)間的糖液糖組分

對(duì)實(shí)驗(yàn)收集的樣品進(jìn)行糖組分檢測(cè)，結(jié)果顯示熊蜂貯藏在蜜罐中的糖液與對(duì)照組相比，糖組分及含量發(fā)生了顯著改變(圖3)。經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)分析，對(duì)照組1～7 d的糖溶液中只檢出蔗糖，且含量恒定為50.00%，而蜜罐中貯藏1～7 d的糖液樣品中均檢測(cè)到果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和海藻糖5種糖。以貯藏3 d時(shí)為例，蜜罐和對(duì)照組的糖組分色譜圖分別如圖3(B)和圖3(C)所示。

貯藏在蜜罐中不同時(shí)間的糖液組分含量如表1所示。單因素方差分析表明，貯藏4 d后果糖含量最高(26.97%±0.69%)，貯藏5 d后葡萄糖含量最高(20.87%±0.10%)，二者極顯著高于其他貯藏時(shí)間(P<0.01)；貯藏1 d時(shí)的蔗糖含量最低(16.94%±0.89%)，極顯著低于貯藏6 d時(shí)(35.78%±0.06%,P<0.01)；貯藏1～4 d時(shí)的麥芽糖含量極顯著高于貯藏 5～7 d時(shí)的(P<0.01)，而貯藏1～4 d時(shí)的海藻糖含量極顯著低于貯藏5～7 d時(shí)(P<0.01)。貯藏4～5 d后己糖(葡萄糖和果糖)含量(平均41.73%)極顯著高于貯藏1～3 d和6～7 d時(shí)的(P<0.01)。

圖2 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同天數(shù)的糖液平均濃度Fig.2 Average concentrations of sugar solution in wax cells stored by Bombus friseanus for different days圖中誤差線下方標(biāo)注的不同小寫(xiě)字母表示貯藏不同天數(shù)的糖液平均糖濃度經(jīng)LSD法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters below the error bars show that the average sugar concentrations of sugar solution during different storage days were significantly different (P<0.05) by LSD test.

相關(guān)性分析表明，總糖中果糖、己糖(果糖和葡萄糖)、麥芽糖含量分別與蔗糖含量具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(果糖:Pearsonr=-0.976,P=0.000;己糖:Pearsonr=-0.738,P=0.001;麥芽糖:Pearsonr=-0.719,P=0.001)，換言之，在釀蜜過(guò)程中果糖和麥芽糖含量隨著蔗糖含量的升高而降低。然而，葡萄糖和海藻糖含量與蔗糖含量變化不相關(guān)(葡萄糖:Pearsonr=0.109,P=0.676;海藻糖:Pearsonr=0.403,P=0.108)。另外，總糖中果糖和麥芽糖含量與貯藏時(shí)間極顯著負(fù)相關(guān)(果糖:Pearsonr=-0.768,P=0.000;麥芽糖:Pearsonr=-0.875,P=0.000)，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)含量降低；葡萄糖、蔗糖和海藻糖含量分別與貯藏時(shí)間呈極顯著正相關(guān)(葡萄糖:Pearsonr=0.684,P=0.002;蔗糖:Pearsonr=0.665,P=0.004;海藻糖:Pearsonr=0.672,P=0.003)，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)含量升高。

圖3 貯藏在弗里熊蜂蜜罐中3 d的糖液和對(duì)照組第3天糖液的碳水化合物色譜圖Fig.3 Chromatograms of carbohydrates in sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus and in the control group for 3 dA:糖的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Chromatogram of standard sugar;B:熊蜂在蜜罐中貯藏3 d的糖液的碳水化合物色譜圖Chromatogram of carbohydrates in sugar solution stored in wax cells of bumblebees for 3 d;C:對(duì)照組第3天糖液的碳水化合物色譜圖Chromatogram of carbohydrates in sugar solution in the control group for 3 d.波峰Peaks:1:果糖Fructose;2:葡萄糖Glucose;3:蔗糖Sucrose;4:麥芽糖Maltose;5:海藻糖Trehalose.

表1 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同天數(shù)的糖液中糖組分含量(%)變化Table 1 Changes in the contents (%) of sugar components in sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus for different days

2.3 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同時(shí)間的糖液中α-淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶的活性

分析發(fā)現(xiàn)貯藏6 d的糖液中α-淀粉酶活性高達(dá)82.86 U/g FW(n=131)，極顯著高于貯藏1～5 d和7 d時(shí)的樣品(P<0.01)；除了貯藏6 d的糖液樣品，其余樣品中α-淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)(表2)。

貯藏在蜜罐中1～7 d時(shí)的糖液，轉(zhuǎn)化酶活性差異不顯著(P>0.05，表2)，所有樣品轉(zhuǎn)化酶活性在21.17～38.05 U/g FW之間(n=126)，轉(zhuǎn)化酶活性平均為27.01～28.85 U/g FW。

表2 貯藏在弗里熊蜂蜜罐中不同天數(shù)的糖液中α-淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶的活性(U/g FW)Table 2 The α-amylase and invertase activities (U/g FW) in sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus for different days

3 討論

蜜蜂科中，熊蜂和蜜蜂是親緣關(guān)系較近的兩個(gè)屬(Hines,2008)，但熊蜂的貯蜜量及貯蜜積極性遠(yuǎn)不如蜜蜂，可能是由于二者的生物學(xué)差異所致。蜜蜂為社會(huì)性昆蟲(chóng)，貯藏蜂蜜有兩方面的重要意義：(1)確保蜂群安全越冬；(2)度過(guò)漫長(zhǎng)的惡劣環(huán)境，例如缺乏蜜源的高溫夏季；而熊蜂為不完全社會(huì)性昆蟲(chóng)，以交尾后的子代蜂王滯育越冬，貯藏蜂蜜僅僅是為了度過(guò)短期低溫陰雨天氣。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂50%的白砂糖溶液后，弗里熊蜂B.friseanus積極取食并將糖液貯藏在蜜罐中，當(dāng)蜂群壯大至80頭工蜂時(shí)，貯藏糖液的蜜罐多達(dá)120個(gè)，盡管貯藏糖液的蜜罐比例大約只有30%～60%，但每個(gè)蜜罐中貯藏的糖液的體積在0.1～2.0 mL間，其中貯藏在工蜂巢房中的糖液較少，而貯藏在工蜂筑造的蜜罐中的糖液較多。弗里熊蜂B.friseanus在云南的垂直分布范圍最廣，主要采集豆科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)和菊科(Asteraceae)植物的花蜜和花粉(Liangetal.,2020)，面臨的生境更加復(fù)雜，貯蜜可能是其在進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)極端天氣的重要生存策略。

在流蜜期，花蜜經(jīng)蜜蜂釀制后，含水量降至18%左右，成熟蜂蜜中的總糖含量升高至75%以上，主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖及少量的松三糖和棉籽糖等(邢晶晶,2009)。本實(shí)驗(yàn)中，蜜罐中糖液的糖組分比對(duì)照組更加豐富，由單一的蔗糖變成了果糖、葡萄糖、麥芽糖和海藻糖，濃度由50.00%升高至81.10%，pH值由6.55降至3.74，表明糖液經(jīng)熊蜂取食并貯藏在蜜罐后發(fā)生了一系列復(fù)雜的物理和化學(xué)變化。研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜的高滲環(huán)境可使細(xì)胞脫水，造成生理干燥，從而抑制病菌生長(zhǎng)(Mandal and Mandal,2011;Kwakman and Zaat,2012;Libonattietal.,2014)。弗里熊蜂B.friseanus釀造后的糖液濃度很高，具有高滲特性，因此釀造后的糖液可能也有一定的抑菌作用，這對(duì)于糖液的短期保存與防腐具有重要意義。

據(jù)報(bào)道，蜜蜂釀蜜初始蔗糖含量越高，蔗糖降解速率越快(Lichtenberg-Kraag,2012)。本實(shí)驗(yàn)中，與蔗糖的起始含量50%相比，熊蜂貯藏1 d后的糖液中蔗糖含量下降最快，與蜜蜂釀蜜生物學(xué)相似。西方蜜蜂A.mellifera和東方蜜蜂A.cerana釀造的蜂蜜以果糖和葡萄糖為主，糖組分一般包括約38%的果糖、31%的葡萄糖，低于5%的蔗糖以及其他的二糖和三糖(Doner,1977)。黃紋無(wú)刺蜂Trigonaventralis蜂蜜中蔗糖含量?jī)H0.80%(梁馨文等,2018)。本研究發(fā)現(xiàn)，糖液經(jīng)弗里熊蜂B.friseanus貯藏4～7 d后，其中蔗糖平均含量為28.27%，果糖為17.58%，葡萄糖為16.67%，表明弗里熊蜂B.friseanus釀造的蜂蜜中蔗糖仍占優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步表明蜂蜜中的糖組分及其比例與物種有關(guān)。此外，弗里熊蜂B.friseanus釀造蜂蜜的后期蔗糖含量不降反升，可能是由于糖液貯藏后期熊蜂群發(fā)育快速，內(nèi)勤蜂消耗了蜜罐中的糖液，外勤蜂重新將飼喂瓶中的新鮮糖溶液添加到蜜罐中，導(dǎo)致樣品中的蔗糖含量波動(dòng)，進(jìn)而影響其他糖組分的含量變化。綜上所述，顯示蜜蜂科的不同物種釀蜜生物學(xué)不同。

本實(shí)驗(yàn)蜜罐中的麥芽糖含量隨著蔗糖含量的增加而顯著降低(Pearsonr=-0.72,P<0.01)，尤其貯藏5,6和7 d的樣品最明顯(表1)，可能是熊蜂分泌并添加了某種異構(gòu)酶使得蔗糖和麥芽糖相互轉(zhuǎn)化。據(jù)報(bào)道，單糖被昆蟲(chóng)吸收到血液后，會(huì)在脂肪體細(xì)胞中合成海藻糖，同時(shí)轉(zhuǎn)化成糖原貯藏在細(xì)胞中(Kuniedaetal.,2006)。另外，酵母、霉菌、藻類、低等維管植物等生物體中也廣泛存在海藻糖，已經(jīng)證實(shí)海藻糖對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用(趙曉峰和吳榮書(shū),2004)。一些微生物體內(nèi)存在海藻糖合酶，可以將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖和葡萄糖(吳傲等,2019)。因此，本研究在蜜罐中檢測(cè)到的海藻糖可能來(lái)源于熊蜂體內(nèi)，通過(guò)熊蜂吞吐糖液而添加，也可能來(lái)源于熊蜂消化道內(nèi)的共生菌。處理組均檢測(cè)到α-淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶，對(duì)照組均未檢測(cè)到這兩種酶，說(shuō)明蜜罐糖液中的生物酶是由弗里熊蜂B.friseanus在取食糖液或者釀造蜂蜜的過(guò)程中添加的。蜜蜂的工蜂在采集花蜜和釀造蜂蜜的過(guò)程中，混入其唾液腺和咽下腺的分泌物，其中淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶使得蜂蜜的化學(xué)組分高度復(fù)雜(Al-Sherifetal.,2017)。淀粉酶能提高蜜蜂對(duì)二糖的利用率，使工蜂飛行更長(zhǎng)的時(shí)間，對(duì)花粉的預(yù)消化也十分重要(Hrassniggetal.,2005)。前人研究表明，蜂蜜中轉(zhuǎn)化酶的本質(zhì)為α-葡萄糖苷酶(White and Maher,1953)，具有水解蔗糖、麥芽糖和海藻糖的作用，將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖(Kubotaetal.,2004;Parvanovetal.,2012)，且在蜂蜜貯藏過(guò)程中繼續(xù)作用，使蔗糖含量持續(xù)下降，轉(zhuǎn)化糖含量相應(yīng)升高，增加蜂蜜的滲透壓。因此，本研究蜜罐樣本中檢測(cè)到的果糖和葡萄糖是由于熊蜂添加的轉(zhuǎn)化酶的作用。

Lichtenberg-Kraag(2014)論證了在蜜蜂釀造的蜂蜜成熟過(guò)程中蔗糖濃度與轉(zhuǎn)化酶活性之間存在極顯著相關(guān)性，蜂蜜中剩余的蔗糖含量越高，檢測(cè)到的轉(zhuǎn)化酶活性就越低。本研究弗里熊蜂B.friseanus貯藏在蜜罐1～7 d的糖液中轉(zhuǎn)化酶活性差異不顯著(P>0.05)，平均27.01～28.85 U/g FW，而蔗糖含量卻隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高(表2)，推測(cè)弗里熊蜂B.friseanus貯藏在蜜罐中的糖液的蔗糖濃度與轉(zhuǎn)化酶活性之間可能不存在顯著相關(guān)性；此外，除了貯藏6 d后的糖液中α-淀粉酶活性顯著升高至82.86 U/g FW外，其余幾天的樣品α-淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)(表2)。但東方蜜蜂A.cerana和西方蜜蜂A.mellifera釀造的蜂蜜中淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶含量在工蜂采集花蜜以及隨著在蜂巢中釀造時(shí)間(7 d內(nèi))的延長(zhǎng)而顯著增加(宗德琴等,2015;葉夢(mèng)迪等,2017)。Al-Sherif等(2012)對(duì)咽下腺的研究表明，卡尼鄂拉蜂Apismelliferacarnica和埃及蜜蜂Apismelliferalamarckii的工蜂在不同的生活階段，咽下腺分泌的轉(zhuǎn)化酶、葡糖氧化酶和淀粉酶的量不同。已有研究人員提出花蜜的粘度決定了蜜蜂分泌的唾液量，從而影響酶的分泌量(Lichtenberg-Kraag,2014)。另外，蜂群內(nèi)的條件如空間大小、蜂群密度以及蜜蜂的遺傳差異也能夠影響蜂群之間轉(zhuǎn)化酶和淀粉酶的活性差異(Lichtenberg-Kraag,2014)。因此，本研究蜜罐中糖液的α-淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶的活性整體上沒(méi)有隨著在蜂巢中貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高或者下降，可能是因?yàn)樾芊涞拿阁w系與蜜蜂存在很大差異，分泌酶的活動(dòng)更加復(fù)雜以及熊蜂的個(gè)體遺傳差異和特殊的貯蜜行為。據(jù)報(bào)道，熊蜂能夠快速評(píng)估糖濃度發(fā)生改變的花朵，并能夠快速地將花朵的顏色、氣味等信號(hào)與花朵的熱量值或“可獲得的凈能量”聯(lián)系起來(lái)(Cnaanietal.,2006;Nachevetal.,2013)。實(shí)驗(yàn)中觀察到，與蜜蜂持續(xù)性貯蜜不同，熊蜂為階段性貯蜜，在蜜罐中貯藏3～4 d后，熊蜂會(huì)選擇性地取食濃度較高的糖液，繼而再次將飼喂瓶中新鮮的濃度較低的糖溶液貯藏到空的蜜罐中，這種特殊的貯蜜方式?jīng)Q定了蜜罐樣品中糖液的濃度、糖組分及α-淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶活性是波動(dòng)變化的，而不是線性升高或下降。

總而言之，弗里熊蜂B.friseanus將蔗糖溶液貯藏在蜜罐中，脫去多余水分，添加生物酶，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間轉(zhuǎn)化成含有多種糖組分、成分多樣的糖溶液，表明其具有釀造蜂蜜的能力。