白蠟窄吉丁氣味結合蛋白AplaOBP3的免疫定位及配體結合特性

宋 玄,王澤華,單 雙,張永軍,王山寧,*

(1.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所,北京 100097;2.中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;3.中國農業大學植物保護學院,北京 100193)

白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis，又名花曲柳窄吉丁、梣小吉丁，屬鞘翅目(Coleoptera)吉丁科(Buprestidae)，主要為害木犀科(Oleaceae)白蠟屬Fraxinus樹木(魏霞等,2004;趙同海等,2005)。該蟲原產于東亞，自2002年傳入北美，因其隱蔽性強，防治極為困難，迄今已造成北美地區數百萬白蠟樹死亡，嚴重威脅多種白蠟屬樹木的生存(Anulewiczetal.,2008;Herms and McCullough,2014;Wendyetal.,2018)。氣味分子介導的該蟲寄主識別和種間通訊已經被證實。白蠟葉片揮發物中至少發現16種化合物能誘發成蟲觸角電位反應，如順-3-己烯醇、乙酸順-3-己烯酯、反-2-己烯醛等，其中順-3-己烯醇對雄蟲有很強的誘集作用(Rodriguez-Saonaetal.,2006)。白蠟樹皮揮發物中的6種倍半萜，包括α-蒎烯、α-可巴烯、α-葎草烯等均對成蟲具有觸角活性，含有這些化合物的兩種植物油manuka oil和phoebe oil在野外對成蟲具有誘捕效果(Crooketal.,2008b)。白蠟窄吉丁雌蟲釋放的具有觸角活性的化合物(3Z)-lactone能夠吸引雄性，被認為是該蟲的性信息素組分(Barteltetal.,2007)。目前已經根據寄主植物揮發物和性信息素研制開發了白蠟窄吉丁的多種引誘劑(Crooketal.,2008b;Silketal.,2015,2019;Katieetal.,2020)。但是，人們對該蟲的化學通訊分子機制還不太了解。

昆蟲感知外界化學信息的過程中，氣味結合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(odorant receptors,ORs)和離子型受體(ionotropic receptors,IRs)等多種嗅覺相關蛋白發揮至關重要的作用(Clyneetal.,1999;Coutoetal.,2005;Bentonetal.,2009;Leal,2013;Joseph and Carlson,2015)。昆蟲氣味結合蛋白(OBPs)是一類小分子的水溶性蛋白，此類蛋白廣泛分布在昆蟲的各類感受器官中(Pelosietal.,2018)。在昆蟲觸角中，OBP蛋白由位于化學感受器下方的輔助細胞合成，隨后被大量分泌到感器腔的淋巴液中，參與結合、溶解、運輸疏水性氣味分子，在昆蟲感受外界環境中的化學信號過程中發揮重要功能(Vogt and Riddiford,1981;Angelietal.,1999;Leal,2013;Pelosietal.,2014,2018)。

昆蟲氣味結合蛋白廣泛存在不同昆蟲中，參與昆蟲信息化合物的識別。在鞘翅目昆蟲大黑鰓金龜Holotrichiaoblita觸角轉錄組中鑒定出29個OBP基因，其中HoblOBP9和HoblOBP13分別參與大黑鰓金龜雌蟲對寄主植物揮發物苯乙醇和反-2-苯烯醇的識別(Yinetal.,2019)。松墨天牛MonochamusalternatusMaltOBP1,MaltOBP3和MaltOBP5能夠與部分寄主植物揮發物結合，它們可能在松墨天牛的寄主選擇過程發揮功能(Gao and Wang,2015;Zhangetal.,2020)。蘋果小吉丁AgrilusmaliAmalOBP3在雌雄觸角中高表達，能夠結合醇類和醛類等多種寄主揮發物(Cuietal.,2018)。本實驗室前期對白蠟窄吉丁基因組數據進行分析，鑒定了11個氣味結合蛋白，組織表達譜結果表明AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3在雌雄成蟲觸角特異表達，熒光競爭結合實驗表明AplaOBP1和AplaOBP2能夠與多種寄主揮發物結合，它們在白蠟窄吉丁寄主識別中發揮功能(Wangetal.,2020;宋玄等,未發表數據)，推測AplaOBP3同樣在白蠟窄吉丁嗅覺感受行為中發揮功能。

為深入解析氣味結合蛋白在白蠟窄吉丁嗅覺感受中的功能，本研究進一步對AplaOBP3蛋白進行了原核表達，利用免疫組化技術檢測了該蛋白的亞細胞定位，通過熒光競爭結合實驗對AplaOBP3重組蛋白與58種化合物的結合特性進行了分析，并對3種氣味結合蛋白(AplaOBP1-3)的表達及配體結合特性進行比較，以期為闡明白蠟窄吉丁氣味結合蛋白參與寄主識別的化學感受機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

于北京郊區白蠟林地，將受害白蠟樹截成約50 cm的木段帶回室內，置于養蟲籠罩內待白蠟窄吉丁成蟲自然羽化，成蟲羽化后轉移至養蟲盒內，飼喂白蠟樹葉片進行飼養，成蟲飼養條件為溫度25±0.5℃，相對濕度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 AplaOBP3重組蛋白的表達與純化

利用SignalP 3.0 Server在線程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預測白蠟窄吉丁AplaOBP3蛋白(GenBank登錄號:XM_025977151.1)信號肽序列，去信號肽后的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司進行化學合成并克隆到原核表達載體pET30a(+)，轉化大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)。將單克隆陽性菌株接種于含100 mg/mL卡那霉素的培養基中37℃ 200 r/min搖床中培養，待OD600值為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，在18℃ 160 r/min搖床中誘導16 h。超聲破碎后分別收集上清及包涵體。參照Prestwich (1993)的方法，進行包涵體的復性和重折疊，即用含0.2% Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)沖洗包涵體，隨后將包涵體溶解在6 mol/L的鹽酸胍中，經氧化還原處理后獲得可溶性蛋白。利用親和層析鎳柱純化，純化的重組蛋白經腸激酶25℃孵育過夜處理后，再次用親和層析鎳柱純化，超濾濃縮后得到無His標簽的AplaOBP3重組蛋白。通過4%～20% SDS-PAGE電泳檢測各階段目的蛋白的表達及純化情況。純化的目的蛋白送北京信諾晶科生物技術有限公司制備多克隆抗體。

1.3 Western blot檢測

收集白蠟窄吉丁成蟲觸角，使用組織蛋白抽提試劑盒(康為世紀生物科技有限公司,北京)提取觸角組織粗蛋白。采用4%-20% SDS-PAGE電泳對觸角組織粗蛋白和純化的重組蛋白AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3進行分離，其中AplaOBP1和AplaOBP2重組蛋白由本實驗室前期實驗獲得(Wangetal.,2020;宋玄等,數據未發表)。采用One Step Western Kit HRP(Rabbit)(康為世紀生物科技有限公司,北京)進行Western blot，檢測AplaOBP3多克隆抗體的特異性；通過高靈敏度化學發光檢測試劑盒(康為世紀生物科技有限公司,北京)進行發光檢測；使用化學發光成像分析儀(AI680,GE,美國)進行曝光及圖像采集。

1.4 免疫組織化學定位檢測

1.3節收集的白蠟窄吉丁觸角樣品送至中國農業科學院農產品加工研究所電鏡室進行固定、制樣包埋、切片、免疫染色及電鏡觀察。1.2節制備的AplaOBP3多克隆抗體按照1∶5 000 (v/v)稀釋使用，以未免疫的兔血清代替抗體作為陰性對照，詳細步驟參照本實驗室前期報道(Wangetal.,2020)，檢測AplaOBP3在白蠟窄吉丁觸角感器中的表達定位。

1.5 熒光競爭結合實驗

為了與前期報道的白蠟窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的配體結合特性進行比較，本研究選取了58種相同的化合物作為候選配體(表1)，其中27種揮發物的選擇是來自于白蠟窄吉丁為害的寄主植物。使用F-380熒光分光光度計(天津港東科技發展股份有限公司)進行熒光競爭結合實驗，激發波長337 nm，掃描發射波長范圍370～550 nm。采用N-苯基-1-萘胺 (N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作為熒光探針。候選配體和熒光探針用色譜級甲醇溶解，配制成濃度為1 mmol/L的工作液。于PBS緩沖液(pH 7.4)中加入AplaOBP3重組蛋白，終濃度為2 μmol/L，再加入1-NPN，使探針濃度從2 μmol/L遞增至12 μmol/L，重復3次，測定熒光強度變化，計算AplaOBP3與探針的結合能力曲線和解離常數。將AplaOBP3加入PBS緩沖液(pH 7.4)中，終濃度為2 μmol/L，加入相同濃度的1-NPN，記錄熒光強度，隨后加入待測配體，濃度從2 μmol/L開始遞增至20 μmol/L，記錄熒光強度變化，重復3次。計算得出使熒光強度降低一半時的配體濃度，即IC50值。利用下列公式計算出配體解離常數KD∶KD=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，[1-NPN]是未結合的1-NPN的濃度，K1-NPN為AplaOBP3與1-NPN的解離常數(Guetal.,2011)。

2 結果

2.1 AplaOBP3的重組表達

SDS-PAGE結果表明，氣味結合蛋白AplaOBP3重組蛋白在包涵體中表達(圖1)，對包涵體進行復性，通過親和層析獲得重組蛋白，腸激酶切去His標簽后得到分子量約為14 kD的目的蛋白，用于抗體制備及競爭性結合實驗。

2.2 Western blot檢測

Western blot檢測了AplaOBP3多克隆抗體與白蠟窄吉丁觸角粗蛋白以及純化的AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3重組蛋白的結合特異性，結果表明，僅在觸角粗蛋白和AplaOBP3蛋白樣品中檢測到分子量約14 kD特異性條帶，表明AplaOBP3多克隆抗體僅與AplaOBP3蛋白結合，可以滿足后續的免疫組織化學檢測(圖2)。

2.3 AplaOBP3在觸角中的表達定位

免疫組化結果表明，黑色膠體金顆粒標記的AplaOBP3蛋白分布在白蠟窄吉丁錐形感器類型Ⅰ的感器腔及感器下方(圖3)。錐形感器類型Ⅰ的感器壁具有明顯的微孔，是嗅覺感受器，推測AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁嗅覺感受過程中發揮著重要的作用。

圖1 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白質分子量標準Protein molecular weight marker;1:未誘導的大腸桿菌菌體Non-induced Escherichia coli;2:經IPTG誘導16 h的大腸桿菌菌體E.coli induced by 1 mmol/L IPTG for 16 h;3:上清液Supernatant;4:包涵體蛋白Inclusion body protein;5:帶His標簽重組蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 with His-tag;6:無His標簽的重組蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 without His-tag.

圖2 白蠟窄吉丁AplaOBP3多克隆抗體的SDS-PAGE (A)和Western blot (B)檢測Fig.2 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of the polyclonal antibody against AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白質分子量標準Protein molecular weight marker;1:提取自白蠟窄吉丁的觸角粗蛋白Crude protein extracted from antennae of A.planipennis;2:AplaOBP1重組蛋白Recombinant AplaOBP1;3:AplaOBP2重組蛋白Recombinant AplaOBP2;4:AplaOBP3重組蛋白Recombinant AplaOBP3.

圖3 AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁觸角的表達定位Fig.3 Expression localization of AplaOBP3 protein in the antenna of Agrilus planipennisA:顯示黑色顆粒標記的AplaOBP3蛋白分布在錐形感器類型Ⅰ的感器腔及感器基部的縱切圖Longitudinal section showing that AplaOBP3 proteins labeled with black spots are distributed in the hair lumen and the base of the sensilla basiconica type I;B:錐形感器類型Ⅰ的感器腔Hair lumen of the sensilla basiconica type I;C:錐形感器類型Ⅰ的感器基部Base of the sensilla basiconica type I；D:顯示AplaOBP3蛋白在錐形感器類型Ⅰ的感器腔中表達的橫切圖,箭頭表示感器上的壁孔Cross section showing the expression of AplaOBP3 protein at the hair lumen of sensilla basiconica type I,arrows indicating the wall pores on the sensillum;E:顯示未免疫的兔血清陰性對照未被標記的縱切圖Longitudinal section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled;F:顯示未免疫的兔血清陰性對照未被標記的橫切圖Cross section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled.

2.4 AplaOBP3重組蛋白配體結合特征

熒光競爭結合實驗結果表明，AplaOBP3與熒光探針1-NPN的解離常數為0.4 μmol/L，1-NPN和重組蛋白AplaOBP3的結合曲線及Scatchard方程見圖4 (A)。AplaOBP3與候選配體的結合曲線(圖4:B)和解離常數(表1)可以看出，在58種氣味揮發物中，AplaOBP3可以特異性結合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、β-紫羅蘭酮和羅勒烯，AplaOBP3與β-紫羅蘭酮結合能力最強，解離常數為1.72 μmol/L，與苯甲醛的結合能力次之，其解離常數為4.03 μmol/L，與反-2-己烯醛的結合能力最弱，其解離常數為6.20 μmol/L。

2.5 AplaOBP3與AplaOBP1和AplaOBP2的表達及配體結合特性比較

AplaOBP3與前期報道的白蠟窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的表達及配體結合特性(表2)進行比較發現，AplaOBP3與AplaOBP2具有相似的表達及配體結合特性，但與AplaOBP1的明顯不同。AplaOBP3和AplaOBP2均在觸角錐形感器類型I表達，而AplaOBP1在錐形感器類型I和III均表達。在58種候選配體中，共有15種化合物至少與一種AplaOBP重組蛋白結合。與AplaOBP3結合的5種配體中，其中4種(反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫羅蘭酮)也與AplaOBP2結合，而與AplaOBP1結合的多數配體與AplaOBP3和AplaOBP2不結合，其中僅羅勒烯與AplaOBP3結合。

圖4 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3的結合特征Fig.4 Binding properties of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisA:1-NPN和AplaOBP3的結合曲線及Scatchard方程Binding curve and Scatchard plot of 1-NPN to AplaOBP3;B:AplaOBP3與候選配體的結合曲線Binding curves of AplaOBP3 to candidate ligands.

3 討論

白蠟窄吉丁觸角上分布有3種多孔的錐形感器，在雌雄成蟲感受外界嗅覺刺激信號中發揮著重要的作用(Crooketal.,2008a)。免疫組化結果表明，AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁錐形感器類型I中表達，推測AplaOBP3可能與嗅覺感受有關。本研究選擇58種揮發物作為候選配體，其中包括27種寄主揮發物，AplaOBP3重組蛋白能與多種揮發物結合，其中與AplaOBP3重組蛋白結合的5種配體中，3種配體即羅勒烯、反-2-己烯醛和4′-乙基苯乙酮屬于白蠟窄吉丁寄主植物白蠟樹的葉片揮發物，它們可以引起白蠟窄吉丁EAG反應，并且反-2-己烯醛對白蠟窄吉丁具有吸引作用(Rigsbyetal.,2017;Wangetal.,2020;宋玄等,未發表數據)，表明AplaOBP3可能在白蠟窄吉丁選擇寄主植物過程中發揮重要嗅覺感受功能。AplaOBP3和AplaOBP2表現出大致相同的表達及配體結合特征，它們均可結合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫羅蘭酮。Zhong等(2018)的研究發現茶翅蝽5種OBPs與報警信息素組分反-2-癸烯醛具有強的結合能力。蘋果小吉丁OBP2和OBP8與十二醇、橙花醇、法尼醇和十二烷等多種配體均具有強的結合能力(Cuietal.,2018)。因此，昆蟲中不同種類的氣味結合蛋白能夠結合同一種揮發物，推測可能共同參與某種化合物的識別。

表1 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3與候選配體結合能力Table 1 Binding capabilities of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennis to candidate ligands

續表1 Table 1 continued

表2 3種AplaOBP蛋白表達及配體結合特征比較Table 2 Comparison of expression and ligand binding characteristics of three AplaOBP proteins

順-3-己烯醇是白蠟葉片揮發物重要組分，其可以引起白蠟窄吉丁的EAG反應，且對白蠟窄吉丁具有誘集活性，已應用于商業化誘餌關鍵組分(Rodriguez-Saonaetal.,2006;Grantetal.,2010,2011)。目前，未發現一種AplaOBP蛋白能夠與順-3-己烯醇結合。白蠟窄吉丁11個AplaOBPs中，除觸角特異表達的3個AplaOBPs以外，AplaOBP6和AplaOBP7基因在觸角的表達量高于其他組織(Wangetal.,2020)，它們是否能夠與順-3-己烯醇結合還需進一步實驗研究。另外，其他水溶性轉運蛋白如化學感受蛋白(CSPs)也可能參與寄主揮發物的識別。Andersson等(2019)對白蠟窄吉丁基因組進行分析，共注釋了14個AplaCSPs基因。目前，關于AplaCSPs在白蠟窄吉丁化學感受中的功能未見報道。我們推測觸角特異或高表達的AplaCSPs也很有可能參與順-3-己烯醇等寄主揮發物的識別。

綜上，本研究對白蠟窄吉丁AplaOBP3蛋白在觸角感器中的定位進行了解析，通過體外功能研究的方法證明AplaOBP3可能參與白蠟窄吉丁對寄主植物揮發物的識別，同時比較了AplaOBP3與已報道的AplaOBP1和AplaOBP2的配體結合異同，為闡明氣味結合蛋白在白蠟窄吉丁寄主識別中的功能奠定了一定基礎，也為基于氣味結合蛋白的功能篩選白蠟窄吉丁新的信息化合物提供了依據。然而，對于氣味結合蛋白在白蠟窄吉丁寄主識別中的具體生理功能還需進一步通過基因干擾或基因編輯進行驗證。