海馬p75神經營養因子受體在老年小鼠術后認知障礙中的作用

高玉竹 ， 紀木火 ， 周志強

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是麻醉手術后常見的中樞神經系統并發癥[1]，表現為記憶力、注意力、信息處理過程及認知靈活性下降等，尤多見于老年患者[2]。POCD嚴重影響其生活自理能力和生活質量，顯著增加家庭與社會經濟負擔[1,2]。然而，目前有關POCD的發病機制仍不清楚。p75神經營養因子受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)，是導致眾多神經退行性疾病神經行為異常的關鍵因素[3]。

研究表明，p75NTR參與成年小鼠炎癥誘導的突觸損傷及認知障礙[4]，敲除p75NTR基因，可有顯著上調海馬神經元突觸密度并改善小鼠認知功能[5,6]。然而，有關p75NTR信號通路在POCD中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討海馬p75NTR在POCD中的作用及機制，為POCD的防治提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 老年雄性C57BL/6小鼠(18～20月齡)30只，購置于常州卡文斯實驗動物有限公司。采用隨機數字法分為3組：對照組、手術組及手術+TAT(TAT-Pep5-Calbiochem，p75NTR抑制劑)組，每組10只。手術后第6天行條件性恐懼實驗，第7天行場景性條件性恐懼實驗。行為學訓練之前30 min腹腔注射TAT(3 mg/kg；506181，Sigma)或等容量生理鹽水。

1.2 POCD模型建立 將手術組小鼠置于透明半封閉呼吸環路麻醉箱中，箱外配有含二氧化碳吸附劑的回收裝置。小鼠放入麻醉箱內前預充1.5%異氟醚+100% O2。待小鼠翻正反射消失后，取右側臥位，保持呼吸道通暢，謹防誤吸，維持麻醉30 min。麻醉箱中氣體濃度由Vamos持續監測多參數麻醉氣體監護儀進行連續監測。手術組小鼠在麻醉后迅速移至手術臺，紅霉素眼藥膏涂抹眼部，將圓錐形面罩固定在小鼠口鼻部。用70%酒精消毒腹部，剪去腹部毛發，70%酒精再次消毒后取腹正中約1.5 cm切口。按順時針方向，依次緩慢探查腸道、肝、脾、腎等腹膜腔臟器，隨后將約3 cm的部分腸道輕輕外露并用拇指和食指輕輕摩擦約30 s，然后將其放回原腹膜腔，保證腸道的方向不發生轉變，總探查時間約10 min。探查結束后用無菌絲線縫合肌肉筋膜及皮膚，術后傷口涂抹硫鏈絲霉素預防感染。皮下注射溫生理鹽水30 ml/kg，補充術中液體丟失;術后將小鼠放入通有100% O2的籠中，保溫處理直至小鼠意識完全恢復。手術+TAT組小鼠手術操作同手術組，并在行為學訓練30 min前給予腹腔注射p75NTR抑制劑TAT(3 mg/kg)。對照組小鼠除持續吸入相同時間100% O2外不進行任何處理。

1.3 曠場實驗 術后第5天行曠場試驗測試，曠場實驗是用來評估動物的探索行為和焦慮行為。將實驗小鼠置于40 cm×40 cm×40 cm的敞箱中心，自由探索5 min。使用自動監視系統(XR-XC404；上海欣軟信息技術有限公司，上海)記錄并分析中央格停留時間和活動總距離。在每次測試結束時，用75%的酒精進行礦場清潔，以消除氣味干擾，充分晾干后繼續實驗。

1.4 條件性和場景性恐懼實驗 本實驗分為訓練和測試階段。術后第6天行條件性和場景性恐懼實驗訓練，將小鼠置于實驗箱(32 cm×32 cm×45 cm)適應3 min后，給予30 s單頻聲音刺激(1 kHZ,80 dB,CS)，然后給予2 s足底電擊(1 mA，US)。24 h后將小鼠再次放入同一實驗箱中，在不給予任何刺激情況下進行場景測試以評估僵直行為，記錄小鼠5 min內的僵直(除呼吸運動外無其他任何行為活動的不動狀態)時間。場景性恐懼實驗結束2 h后，改變環境(實驗箱底部放入分隔板，四壁粘貼不同形狀、顏色塑料板等)，在新場景中測試線索恐懼記憶，行條件性恐懼測試。給予小鼠連續3 min和訓練時相同的聲音刺激(180 s，70 dB，3000 Hz)，同時記錄3 min內小鼠的僵直時間。使用自動監視系統(XR-XC404；上海欣軟信息技術有限公司，上海)記錄并分析。通過監測小鼠僵直行為時間來評估認知功能障礙，在每次測試結束時，用75%的酒精進行礦場清潔，以消除氣味干擾，充分晾干后繼續實驗。

1.5 Western blot檢測 行為學結束后2 h,每組隨機選擇4只小鼠斷頸處死，置于冰上取雙側新鮮海馬組織。將海馬標本置于添加蛋白酶抑制劑的低溫裂解緩沖液中進行裂解，研磨組織，4 ℃離心(12000 r/min，10 min)取上清液。提取上清液后，使用Braford法定量蛋白濃度， 95 ℃煮5 min，使蛋白變性。電泳轉膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。加入一抗4 ℃過夜，次日TBST漂洗10 min×3次;二抗室溫孵育2 h并漂洗3次，底物顯色反應、曝光顯影。采用Image J軟件檢測海馬p75NTR、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、原肌球蛋白受體B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)、環磷酸腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)含量。一抗二抗貨號下：p75NTR(55014-1-AP)、BDNF(ab108319)、PSD95(ab238135)、TrkB(ab187041)、pCREB(MABN1194)、GAPDH(60004-1-Ig)及二抗 (A0208、A0216)。

1.6 免疫熒光 采用免疫熒光技術比較CA1、CA3及DG區caspase-3陽性細胞數的變化。小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，經心灌注生理鹽水，然后用4%多聚甲醛溶液灌注后取腦。4 ℃溫度下30%蔗糖溶液中脫水過夜，OCT包埋后使用低溫保持器將其切割成30 μm厚的切片。切片在室溫下用5%小牛血清白蛋白封閉1 h，擦干后加一抗(caspase-3，AB3623,Millipore，1∶500)，4 ℃過夜。用PBS洗滌3次后，加帶熒光標記的二抗。二抗洗凈后，使用含DAPI的抗熒光萃滅封片劑進行封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。用Image J測量各切片的免疫熒光均值。

1.7 高爾基染色 采用FD快速高爾基染色試劑盒進行高爾基染色。行為學結束后2 h,每組隨機選擇3只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，麻醉后斷頭取全腦，沖凈大腦表面的血漬后，將大腦浸泡在浸漬液(10 ml溶液A+10 ml溶液B等體積混合)中，24 h后更換一次新的AB液后，室溫避光保存24 d；隨后轉移至溶液C(15 ml)中浸泡，24 h后更換一次新的溶液C，室溫避光保存 7 d。使用冰凍切片機切片，厚度為100 μm。室溫晾干；PBS洗滌2×4 min。將腦片置于混合液(5 ml溶液D+5 ml溶液E+10 ml 雙蒸水)中浸泡10 min。miliQ 水洗滌2×4 min。腦片復染(硫堇)，PBS洗滌2×4 min。先后分別使用50%、75%和 95%乙醇對腦片進行梯度脫水一次，每次4 min。隨后，無水乙醇脫水4×4 min，二甲苯透明3×4 min，中性樹膠封片劑封片，通風櫥晾干。Olympus(物鏡20×和100×)拍攝海馬CA1區神經元樹突棘。使用 Image J 圖像分析軟件、Neuro J插件分析小鼠海馬 CA1區神經元樹突棘數目。

2 結 果

2.1 P75NTR含量 免疫印跡結果顯示，與對照組比較，手術組動物海馬P75NTR表達水平顯著增高(P<0.05)(見圖1)。

2.2 行為學變化 曠場實驗中，各組動物在總探索路程、中央格停留時間無顯著差異(P>0.05)。與對照組比較，手術組動物場景僵直時間均顯著降低(P<0.05)，手術+TAT組場景僵直時間較手術組而言顯著增加(P<0.05)。3組實驗小鼠條件性恐懼實驗中聲音僵直時間比較均無差異(P>0.05)(見表1)。

2.3 Caspase-3陽性細胞數 免疫熒光結果顯示，與對照組比較，手術組小鼠海馬各區caspase-3陽性細胞數顯著增加(P<0.05)；與手術組比較，手術+TAT組小鼠海馬各區caspase-3陽性細胞數顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

2.4 海馬BDNF、PSD95、TrkB、pCREB含量 與對照組比較,手術組動物海馬BDNF、PSD95、TrkB及pCREB表達顯著降低(P<0.05)；與手術組比較，手術+TAT組動物海馬BDNF、PSD95及pCREB表達顯著增加(P<0.05)(見圖3)。

2.5 海馬CA1區神經元樹突棘 與對照組比較，手術組小鼠海馬CA1區突觸數目顯著降低(P<0.05)；與手術組比較，手術+TAT組小鼠海馬CA1區突觸數目顯著增加(P<0.05)(見圖4)。

表1 曠場實驗及條件性恐懼實驗結果

與對照組比較aP<0.05

與對照組比較aP<0.05；與手術組比較bP<0.05，標尺=100 μm

與對照組比較aP<0.05;與手術組比較bP<0.05

3 討 論

本實驗結果表明，手術可引起老年小鼠場景性恐懼實驗測試的僵直時間明顯降低，提示海馬依賴性恐懼記憶能力受損，表明POCD模型制備成功。此外，POCD老年鼠海馬p75NTR表達水平顯著上調，抑制p75NTR可使caspase-3陽性細胞數顯著降低，BDNF、PSD95、TrkB及pCREB表達顯著增加，同時海馬神經元樹突棘密度也顯著增加，條件性恐懼實驗測試的僵直時間顯著增加。這些結果表明p75NTR在POCD中發揮關鍵作用。

研究發現，海馬相關的學習記憶能力受突觸可塑性調控，突觸功能異常與神經退行性病變中的認知障礙的發生密切相關[7]。在神經退行性病變中，p75NTR是調控神經元凋亡、損傷突觸可塑性的重要因素[8]。研究表明p75NTR以低親和力與神經營養素結合，從而介導神經元存活、分化和髓鞘形成[9]。近年研究表明：p75NTR與神經營養素前體分子如腦源性生長因子前體以高親和力結合，導致c-Jun氨基末端激酶和caspases的激活，該通路參與神經元凋亡[10]。p75NTR表達于海馬神經元的細胞膜，是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，是由黑色素瘤細胞系A785中分離出來的跨膜神經營養受體。在阿爾茲海默癥模型小鼠的研究中發現，敲除p75NTR基因后，小鼠海馬齒狀回神經元樹突棘密度顯著增加，同時小鼠的學習記憶能力也顯著改善[6]。在另一項研究中，使用p75NTR抑制劑，可顯著改善老年小鼠在水迷宮實驗中的學習記憶表現[11]。本實驗結果與先前研究相似，POCD老年小鼠海馬內p75NTR含量增加，海馬區caspase-3陽性細胞數增多，細胞凋亡進程亢進，同時伴有學習記憶能力受損。抑制p75NTR信號通路，POCD模型老年小鼠海馬區凋亡細胞減少，同時學習記憶能力改善。

記憶能力與突觸可塑性均受神經營養因子及突觸相關蛋白調節[12,13]。BDNF在中樞神經系統中分布廣泛，促進神經元軸突和樹突生長及突觸的形成，調節學習記憶功能。BDNF通過激活TrkB上調細胞外信號調節激酶，促進轉錄因子CREB磷酸化，進而上調保護性蛋白，如BDNF、PSD95等基因的轉錄，促進神經元發生[14]。PSD-95作為突觸后膜胞質面細胞骨架網內最主要的細胞骨架蛋白，是突觸后致密物大小和突觸強度的重要決定因素，在神經元發育、長時程增強及認知功能中均非常必要，在突觸結構、功能和可塑性等方面也發揮重要作用[15]。而p75NTR發揮與BDNF相反的神經生物功能,p75NTR與proBDNF結合后促進神經元凋亡，抑制突觸可塑性[16]。本研究中，可觀察到POCD老年小鼠海馬內BDNF、TrkB、pCREB表達顯著下降，神經保護因子分泌減少，促使神經細胞功能障礙；同時伴有海馬內PSD95的含量顯著下調，CA1區神經元樹突棘數量減少，出現記憶功能損傷。使用p75NTR抑制劑后，小鼠海馬內BDNF、TrkB、pCREB及PSD95含量顯著上調，同時改善小鼠的認知功能。這些結果表明，手術小鼠的記憶缺陷與神經營養因子和突觸相關蛋白的表達失調有關，而抑制p75NTR可有效改善突觸可塑性。

綜上所述，P75NTR通過促進神經凋亡等機制介導神經元突觸功能異常，進而導致POCD發生。通過阻斷P75NTR途徑，可以有效改善POCD。然而，我們未深入探討p75NTR上調后通過何種機制影響神經因子表達，這有待后續進一步深入的研究。