Rho激酶抑制劑介導(dǎo)RhoA/ROCK2通路對VaD大鼠海馬神經(jīng)元的保護機制

胡躍強， 向軍軍， 鄧秋媚， 吳 林， 莫雪妮， 陳 煒， 姚 春

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是指由一系列腦血管因素引起的在腦組織損害基礎(chǔ)上產(chǎn)生的以高級神經(jīng)認知功能障礙為主的臨床綜合征[1,2]。其確切的發(fā)病機制尚未完全清楚，但臨床療效也不甚理想[3]。因此，對于VaD的機制及治療研究顯得十分迫切。新近研究發(fā)現(xiàn)，小G蛋白RhoGTP酶亞家族(ras homolog gene family member A，RhoA)/Rho激酶(rho-associated protein kinase,ROCK)通路在軸突生長分化、樹突棘形成和維持以及記憶過程中起重要作用[4]。在認知障礙患者腦組織中，RhoA/ROCK2活性上調(diào)[5]，而降低ROCK2的表達，或者抑制Rho或ROCK2的活性均可減緩認知障礙的發(fā)展[6]，故其有望成為治療VaD的重要靶點。本研究采用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)基因干擾技術(shù)表達短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(Short hairpin RNA,shRNA)抑制RhoA/ROCK2信號通路，觀察其對VaD大鼠的影響，以期為防治本病提供新靶點和新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SPF級SD大鼠40只，3月齡，體重(250±50)g，由湖南斯萊克景達物實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK湘2019-0004。隨機分成4組(n=10)：假手術(shù)組、模型組、ROCK2干擾組(腺相關(guān)病毒)、對照組(ROCK2空載體病毒)。

1.2 藥物制備及主要儀器試劑 (1)實驗藥物 AAV9-ROCK2-shRNA注射液及空載體病毒：由上海吉滿生物科技有限公司制造;(2)主要試劑:引物及內(nèi)參(天根生物科技有限公司)，BCA試劑盒、β-actin抗體(碧云天生物公司)；兔抗RhoA多克隆抗體、兔抗ROCK2單克隆抗體、兔抗MLC多克隆抗體(美國Abcam)；兔抗MLCP單克隆抗體(北京Bioss)。

1.3 實驗?zāi)Ｐ椭苽浼八幬锔深A(yù)方法 參照文獻制備VaD大鼠模型[7]，評估模型成功后，將AAV-ROCK2-shRNA原液稀釋至5.07E+12VG/ml，采用腦立體定位儀將ROCK2干擾劑注射海馬組織，每只動物注射總量4 μl，持續(xù)5 min；陰性對照組注射等量空載體病毒。術(shù)后各組大鼠正常喂養(yǎng)，觀察4 w。

1.4 指標觀察

1.4.1 學(xué)習(xí)記憶能力測定 定位航行實驗：第1周、第4周，每組大鼠每天上下午從4個象項各訓(xùn)練一次，將大鼠尋找平臺的時間設(shè)置為120 s，記錄大鼠從入水到爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期，此作為大鼠空間學(xué)習(xí)能力的檢測指標。空間搜索實驗：大鼠完成定位航行實驗后，于第1周、第4周進行空間探索實驗，撤走平臺，依次將大鼠從4個象限放入水中，分別記錄其跨越原來平臺的次數(shù)作為空間記憶的檢測指標。

1.4.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time PCR)測各組大鼠RhoA、ROCK2、MLC、MLCP mRNA表達 取海馬組織置于1 ml EP管內(nèi)，在-80 ℃條件下保存，總RNA運用Trizol法提取，提取完成后取2 μg RNA開始逆轉(zhuǎn)錄。引物序列：β-actin：上游5’-GCGCAAGTACTCTGTGTGG-3’，下游5’-AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG-3’;RhoA上游5’-AGGATTGGCGCTTTTGGGTA-3’，下游5’-TTCACAAGATGAGGCACCCC-3’；ROCK2上游5’-ACAAACCAAGCTAACTGCCT-3’，下游5’-CTACGGGTGCGGTTCTTTCT-3’;MLC上游5’-CTCGGACGAGTGAACGTGAA-3’，下游5’-GAGAACCTCTCTGCTTGCGT-3’；MLCP上游5’-CCCGAGGAT GTGATCACTGG-3’，下游5’-TGCGGCTACAAGCCTATCTG-3’。逆轉(zhuǎn)錄后擴增條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)，最后完成72 ℃總延伸5 min，每組各取5 μl PCR產(chǎn)物電泳，凝膠成像儀獲取圖像，2-△△CT對樣本基因進行表達差異相對定量分析。

1.4.3 Western blot檢測大鼠RhoA、ROCK2、MLC、MLCP蛋白表達 按說明書提取各組大鼠海馬組織蛋白，用BCA試劑盒測定并調(diào)整每個樣本蛋白濃度之后上樣，連接電泳裝置及電源，電壓設(shè)為120 V恒壓，1.5 h后停止電泳；用封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)室溫封閉膜2 h，用新配制的封閉液稀釋抗體4 ℃孕育過夜；用封閉液稀釋各蛋白一抗對應(yīng)的二抗，室溫下孵育膜1 h，用PBST洗膜用于圖像采集；加ECL工作液，在凝膠成像儀下曝光成像，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行圖像分析，獲取各組Western blot條帶的平均光密度(OD)值，內(nèi)參為β-actin，目的蛋白與內(nèi)參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.4.4 透射電鏡觀察海馬病理變化 大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出腦組織，取2 mm×2 mm×2 mm大小的右側(cè)海馬CA1區(qū)組織1塊，置于2.5%戊二醛預(yù)固定然后入1%鋨酸繼續(xù)固定，經(jīng)70%、80%、95%乙醇、無水丙酮脫水、環(huán)氧樹脂Epon812浸透和包埋，全自動石蠟切片機超薄切片，厚度約4 μm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察海馬組織的結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)檢測 組間比較，術(shù)前各組大鼠潛伏期及跨越平臺次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1 w，模型組、陰性對照組與ROCK2干擾組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01或0.05)；術(shù)后4 w，與模型組比較，ROCK2干擾組潛伏期縮短、跨越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05)，陰性對照組潛伏期時間與跨越平臺次數(shù)較模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 各組大鼠RhoA/ROCK2通路相關(guān)基因mRNA表達的變化 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及陰性對照組RhoA、ROCK2、MLC、MLCP mRNA表達量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，ROCK2干擾組RhoA、ROCK2、MLC、MLCP表達量mRNA含量顯著下降(P<0.05)，模型組與陰性比較四者的mRNA表達量無明顯變化(P>0.05)(見表2)。

2.3 各組大鼠RhoA、ROCK2、MLC、MLCP蛋白的表達變化 Western blot檢測結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組及陰性對照組RhoA、ROCK2、MLC、MLCP蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，ROCK2干擾組四者表達顯著下降(P<0.05)；模型組與陰性對照組比較四者的蛋白表達量無明顯變化(P>0.05)(見表3、圖1)。

2.4 電鏡觀察大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化 如圖2所示，假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)正常且清晰，突觸前膜有大量球形突觸小泡，可見清晰的線粒體，突觸間隙寬度及形態(tài)正常，突觸后膜厚度正常且均勻；模型組與陰性對照組突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，細胞器結(jié)構(gòu)不清晰，突觸小泡分布零散且形態(tài)模糊；ROCK2干擾組突觸結(jié)構(gòu)清晰，前膜和后膜形態(tài)正常，可見清晰的線粒體結(jié)構(gòu)，突觸間隙寬度正常(見圖2)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮行為學(xué)檢測比較

表2 各組大鼠RhoA/ROCK2通路相關(guān)基因mRNA表達的變化

表3 各組大鼠RhoA/ROCK2通路相關(guān)蛋白OD值的表達水平比較(n=5)

(1～4道分別代表假手術(shù)組、模型組、ROCK2干擾組、陰性對照組) (×10000，A：假手術(shù)組；B：模型組；C：ROCK2干擾組；D：陰性對照組)

3 討 論

RhoA/ROCK信號通路被稱為肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)器，也是細胞形態(tài)異質(zhì)性的調(diào)節(jié)器[8]。在神經(jīng)發(fā)育過程中，Rho/ROCK信號通路參與軸突生長及軸突生長抑制因子到生長錐的肌動蛋白細胞骨架信號換能過程[9,10]，在傳導(dǎo)髓磷脂相關(guān)抑制因子引起肌動蛋白細胞骨架重組、生長錐塌陷及抑制神經(jīng)突起延伸過程中起著關(guān)鍵作用，已成為神經(jīng)損傷發(fā)生的重要病理機制[11]。激活后的RhoA/ROCK2可以影響許多生物學(xué)行為，包括細胞骨架的組裝、轉(zhuǎn)錄因子的激活、細胞周期的調(diào)節(jié)等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)突觸可塑性，而抑制Rho/ROCK信號通路可促進軸突再生及神經(jīng)功能恢復(fù)[12]。

肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)是Rho激酶(ROCK2)下游底物之一，其表達與突觸再生密切相關(guān)。細胞內(nèi)的MLC磷酸化水平對調(diào)節(jié)突出再生起到重要作用，在肌球蛋白輕鏈激酶和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)雙重調(diào)節(jié)下，MLC發(fā)生磷酸化和去磷酸化的相互轉(zhuǎn)化[13]。

研究已證實，過表達的MLC可增加與肌動蛋白絲交聯(lián)產(chǎn)生的收縮力，最終造成細胞骨架的重排和軸突生長的抑制，導(dǎo)致生長錐塌陷、回縮，抑制軸突生長[12]。抑制Rho/ROCK通路可減少MLCP的肌球蛋白結(jié)合亞單位，降低MLCP的磷酸酶活性，減少MLC磷酸基團的水解；換言之，抑制RhoA/ROCK2可改善細胞骨架重排、促進軸突生長，這可能成為治療VaD的新靶標。因此，本研究通過檢測VaD大鼠海馬RhoA/ROCK2通路及下游MLC、MLCP的表達情況，證實沉默ROCK2表達可導(dǎo)致海馬組織中RhoA、ROCK2、MLC、MLCP的表達顯著下調(diào)，從而起到神經(jīng)保護作用。國內(nèi)陳玲麗通過制作氟致小鼠智力損傷模型，得出相似的研究結(jié)果[14]。

通過本實驗研究，我們認為具有較高的安全性、低免疫原性、可持續(xù)表達等特性腺相關(guān)病毒(AAV)載體[15]轉(zhuǎn)染的ROCK2抑制劑可能通過抑制Rho/ROCK信號通路及其下游分子的傳導(dǎo)，進一步促進軸突的生長及神經(jīng)元的修復(fù)，從而改善智能，其機制值得進一步探索。