蛋白–配體復合物的結構及其相互作用分子機制的虛擬仿真實驗項目的建設與教學實踐
——COVID-19肺炎疫情防控時期線上教學的案例

萬堅，任彥亮，饒立，魏林，李永健，鄧陽，孟祥高，原弘

華中師范大學化學學院，化學國家級實驗教學示范中心，武漢 430079

結構化學是在原子、分子的水平上研究微觀物質運動規律，微觀物質結構以及其與化學性質之間關系的科學，是化學學科的理論基礎。為了讓學生更好地學習和掌握結構化學相關知識，我們構建了模塊化、功能化的“結構化學課程群”[1]，包括結構化學、分子模擬基礎、理論與計算化學課程，進行分類分層教學，以滿足學生個性化發展需求[2]。由于該課程群所涉知識大多抽象、理論性強、數理要求高，學生在學習過程中會遇到相當大的挑戰。為提高學生的學習積極性，幫助學生掌握化學學科的理論基礎、學科思維、學科表達和學科應用，全面培養學生終身發展所需的學習力、思考力和發展力，在長期的教學實踐中，我們逐步構建、完善并實施了基于現代教學理念和理論的“四輪驅動”教學策略和方法，如圖1所示。

圖1 本虛擬仿真實驗項目在結構化學課程群教學中的定位與作用示意圖

該教學策略方法包括由點到面的知識框架圖(Schema)的系統凝練；充分體現“數-形結合”能力與素養，且由淺入深的挑戰性問題(Challenge Question, CQ)的探索解決；問題導向、基于課程項目、注重過程評價的“深度”教學實踐(Problem Oriented，Project-Based, Process-Evaluated Teaching and Learning，P3OBE)的分組實施；以及通過學習者充分準備和參與的口頭報告與研討(Oral presentation and discussion)環節，完成上述幾類“深度”學習任務，自我完善后以“微課”總結提交最終學習“成果”的綜合訓練。“蛋白–配體復合物的結構及其相互作用分子機制”的虛擬仿真(Virtual Simulation，VS)實驗項目是“結構化學課程群”理論教學的實踐和應用，既是P3OBE由淺入深、不可或缺的重要組成部分，亦是后續P3OBE進入高階訓練的線上仿真實驗教學的入門環節(圖2)，充分體現了“能實不虛，虛實結合，虛為實用”的虛擬仿真實驗三原則。虛似仿真實驗網址：http：//www.ilabx.com/details/v5?id=4299&isView=true。

圖2 “雙輪驅動”的蛋白–配體結合構象精確預測的P3OBE實踐學習框架圖

1 實驗內容

蛋白–配體結合構象是生物體系分子識別、生理生化性質與功能的分子機理、基于結構的藥物設計等研究領域中的一個最基本，同時也是最重要、最復雜的關鍵科技問題。對蛋白–配體結合構象的研究與結構化學課程群強調的“宇內萬物由物質組成，相互作用決定其結構，結構決定其性質與功能”的學科思想高度契合。蛋白環境及其相互作用決定了蛋白–配體的結合構象及其結合能力強弱，而蛋白–配體結合構象和結合能力又決定了該配體的生物活性的大小。目前獲得蛋白–配體結合構象最可靠的實驗方法是X射線晶體衍射結構分析，為此本實驗內容包括了：X射線衍射法測定晶體結構的基本原理以及晶體學的相關基礎知識；蛋白質和配體小分子相互作用的主要類型和特征，蛋白–配體復合物的主要功能——催化與抑制催化的機理。受制于蛋白質的復雜性(分子量大、純化表達困難、晶體培養條件苛刻、晶體分辨率低等)，通過實驗手段解析蛋白質及其配體復合物結構信息往往成本高、難度大。運用現代分子模擬方法對蛋白–配體的結合構象進行理論計算預測無疑是對上述實驗方法的一個有益、重要且必須的補充，同時也是結構化學研究中的重難點內容。因此，學習和掌握蛋白–配體結合構象理論計算的基本原理和步驟是本虛擬仿真實驗的第三個研究內容。目前應用最廣泛的蛋白–配體結合構象計算方法是分子對接，該方法速度快但準確性不高，這是由于分子對接在計算時為了節省計算量而忽略了電子效應。我們通過引入量子力學計算發展了DOX方法[3,4]，顯著地提高了蛋白–配體結合構象計算的準確性。所以，本虛擬仿真實驗教學亦是我們相關科研成果的轉化。在本實驗中，學生將同時體驗和比較X射線晶體衍射結構分析、分子對接和DOX，深入理解“微觀物質結構由微觀物質運動法則即量子力學決定，而微觀物質結構又決定其在宏觀世界的功能”這一結構化學基本理念，并強化對學科知識和學科應用的掌握。同時，通過上述虛擬仿真實驗項目的探究學習也為“結構化學課程群”后續系統的 P3OBE實踐打下較為堅實的知識與方法應用的前期基礎。

2 實驗原理

2.1 X射線衍射晶體結構分析

1912年，Laue將一束X射線穿過硫酸銅晶體，成功地觀察到了X射線衍射圖像。該實驗解決了兩個爭論已久的問題：首先證明X射線是波長很短的波，其次證明晶體是原子有規則排列而成的固體。該實驗揭開了通過X射線衍射測量晶體結構的序幕，基于此貢獻，Laue在1914年獲得了諾貝爾物理學獎。隨后Bragg父子在Laue的基礎上給出了晶體結構與衍射方向之間的定量關系，奠定了X射線晶體結構分析的基礎，這就是著名的Bragg方程：2dsinθ=nλ，式中d是晶體中的晶面間距，θ是入射X射線與晶面的夾角，λ是X射線的波長。上述公式表明，當n為正整數時，若等號成立，即可觀察到疊加而成的衍射光。因此，當觀察到衍射光時，可根據該夾角和入射光的波長計算出晶面間距，獲得晶胞的大小和形狀。此外，衍射強度決定了各原子在晶胞中的位置，通過測量X射線穿過晶體時產生衍射光的衍射方向和強度，可以推算出晶體的微觀結構，這就是X射線衍射晶體結構分析。

2.2 蛋白質晶體結構分析

1958年，英國科學家John Kendrew和Max Perutz最先發表了用X射線衍射得到的高分辨率肌紅蛋白Myoglobin的三維結構[5]，開創了蛋白質晶體結構分析技術。兩位科學家也因此獲得了1962年的諾貝爾化學獎。當前蛋白質晶體結構分析的基本流程是，首先通過基因克隆技術獲得大量用于結晶的高純度目的蛋白質，然后將蛋白質與預先配好的結晶溶液進行混合，利用懸滴法獲得蛋白質晶體。懸滴法結晶的基本原理是通過蒸發降低蛋白質溶液中水含量，使得蛋白質結晶析出。結晶溶液中主要包括緩沖溶液、沉淀劑、離子鹽。其中，緩沖溶液的作用是保持整個體系的pH穩定；沉淀劑的作用是使得體系的水含量降低，促使蛋白質結晶析出；離子鹽主要用于中和蛋白表面的電荷，增加蛋白之間碰撞堆積的概率。蛋白質通過懸滴法生長2–30天達到一定尺寸后，便可撈出放入液氮中保存，送往X射線光源進行衍射實驗。值得一提的是，蛋白質雖然是大分子，但晶體尺寸往往十分小。因此蛋白質晶體中結構基元總數較少，衍射光較弱。為獲得高精度的結構數據，則需要使用強度極高的 X射線。同步輻射光源通過令高速運動的電子在磁場中作曲線運動來產生高強度 X射線，是進行蛋白質晶體衍射實驗的理想光源。目前我國已建成的同步輻射光源中最先進的是上海同步輻射光源。

2.3 蛋白–配體相互作用

配體是指各類能和蛋白質結合的小分子，包括金屬離子、輔因子、底物、抑制劑或激動劑分子等。它與蛋白質的結合作用主要來自于蛋白質原子與配體原子之間形成的氫鍵、離子鍵、靜電作用和疏水作用，有時也包括共價鍵。蛋白–配體相互作用對蛋白質的功能起著至關重要的作用，例如酶蛋白催化反應的本質是酶蛋白通過與底物分子的相互作用促使底物轉化為產物。若用另一小分子代替底物與酶蛋白結合，便可阻斷蛋白-底物相互作用，起到抑制酶蛋白活性的作用，這就是抑制劑的原理。而抑制劑是當前創新藥物研發的熱點。以本實驗中的人體 HMG-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，以下簡稱HMGR)[6]為例，HMGR在人體中負責催化從3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)到甲羥戊酸(MVA)的合成反應，這一反應恰好是肝細胞合成膽固醇過程中的關鍵步驟。因此，抑制HMGR酶蛋白的活性可降低體內膽固醇，從而治療高血脂及相關疾病，著名的他汀類降血脂藥物，如明星藥美伐他汀(Mevastatin)和洛伐他汀(Lovastatin)等，均屬于HMGR抑制劑。

2.4 蛋白–配體結合構象的計算

準確解析生物大分子-配體相互作用的三維空間結構(結合構象)是生物體系分子識別、生理生化性質與功能的分子機理、基于結構的藥物設計等研究領域中的一個最基本同時也是最重要、最復雜的關鍵科技問題。目前該領域常用的實驗方法主要有晶體 X射線衍射法、高分辨液相核磁共振法(NMR)，以及近幾年逐漸受到關注的冷凍電鏡技術。然而受制于生物大分子的復雜性(分子量大、蛋白純化表達困難、晶體培養條件苛刻、晶體分辨率低等)，通過實驗手段快速解析蛋白質等生物大分子及其配體復合物結構信息的方式仍然受到限制和挑戰。運用現代分子模擬方法對生物大分子-配體的結合構象進行理論預測無疑是對上述實驗方法的一個有益、重要且必須的補充，同時也是理論與計算化學復雜體系與方法研究中的重要內容。理論計算研究生物大分子中配體分子基態和激發態的性質與功能的前提就是要獲得準確的生物大分子與配體分子的結合構象。因此，在沒有蛋白復合物晶體或高分辨 NMR等實驗結構數據的情況下，發展復雜生物體系的理論計算策略與方法以獲得準確的生物大分子與配體的結合構象成為該研究領域首先需要解決的關鍵科學問題。

2.4.1 傳統蛋白–配體結合構象計算方法：分子對接

目前應用最廣泛的蛋白–配體結合構象計算工具是分子對接。分子對接是通過研究配體(如藥物小分子)和受體(如蛋白質或其他生物大分子)間相互作用，并預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法。它是依據配體與受體作用的“鎖-鑰原理”(lock and key principle)模擬小分子配體與受體生物大分子間的相互作用的，這種相互作用主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。

分子對接首先產生一個填充受體分子表面口袋或凹槽的球集，然后生成一系列假定的結合位點。依據受體表面的這些結合點與配體分子的距離匹配原則，將配體分子投映到受體分子表面，并通過旋轉和扭動配體分子得到一組可能的受體-配體結合構象。之后，計算這些結合構象的親和力，并對計算結果進行打分，按得分高低判定最優受體配體結合構象并基于該構象給出對配體與受體的結合能力的計算。分子對接的種類主要包括：(1) 剛性對接：在對接過程中，研究體系(受體和配體)的構象不發生變化。適合考察比較大的體系，如蛋白質和蛋白質之間以及蛋白質和核酸之間的對接。(2) 半柔性對接：指在對接過程中，研究體系尤其是配體的構象允許在一定的范圍內變化。適合處理大分子和小分子間的對接，且在對接過程中，小分子的構象一般是可以變化的，但大分子是剛性的。(3) 柔性對接：指在對接過程中，研究體系的構象基本上可以自由變化。一般用于需要精確考慮分子間識別的情況。但是由于計算過程中體系的構象可以變化，所以柔性對接計算耗費最大。目前應用最廣泛的是半柔性分子對接計算。

2.4.2 高精度蛋白–配體結合構象預測策略與計算方法：CSAMP-Strategy Based DOX Method

目前傳統分子對接計算方法獲廣泛應用，它的優點是計算速度快，但同時也有計算精度不高的問題。根據文獻中對七種主流分子對接程序的系統評測，可以發現，以預測/正確構象差異RMSD ＜0.2 nm為標準，不同分子對接方法的準確率大致在30%–60%，盡管RMSD ＜ 0.2 nm的標準并不算嚴格。

文獻報道還發現分子對接搜索構象的效率較高，在所產生的全部結合構象中往往已包含“正確”結合構象。其預測結果不準的根源在于構象排序所用的經驗打分函數的精度有限。若用更高精度的理論取代經驗打分函數對構象進行排序，即可提高結合模式預測的準確度。我們課題組與復旦大學徐昕教授合作，基于上述思路發展了高精度蛋白–配體結合模式計算方法DOX。DOX方法的主要特點是利用CSAMP (Conformation Search Across Multiple-Level Potential-Energy Surfaces)策略[3]，將分子對接、半經驗量子化學理論和第一性原理密度泛函理論進行有機結合。所謂CSAMP策略即是用低精度理論進行全局構象搜索，用中精度理論進行構象篩選，用高精度理論進行構象排序。該策略結合了低精度理論的高效率和高精度理論的準確性，從而允許我們利用較少的計算量逼近計算量無法估計的高精度搜索全勢能面的結果，實現第一性原理級別的高精度構象預測。在 DOX方法中，PM7半經驗方法被用于對 Surflex Dock產生的 300個構象進行篩選，取前 10個用 eXtended ONIOM(XO)計算進行最終排序。XO是徐昕教授課題組開發的復合計算化學理論方法，通過分塊計算顯著降低高標度理論的計算量，從而實現巨大體系的密度泛函理論計算。

在Astex標準測試集上的測試結果表明DOX方法的結合模式計算準確率(以RMSD ＜ 0.2 nm為標準)高達99%，顯著優于分子對接的表現。采用更嚴苛的標準(RMSD ＜ 0.1nm)，DOX方法的準確率仍可達到70%以上，這意味著DOX計算的精度已接近晶體結構。需要說明的是，DOX1.0方法已于2016年發表[4]，DOX2.0方法于2019年發表[3]。目前可通過訪問DOX網頁服務器進行計算服務(http：//202.114.32.71：10280/wandox/ DOXserver/home.html)。

3 實驗方法與步驟要求

3.1 實驗方法描述

原子、分子等微觀結構的相互作用是化學實驗的核心，但宏觀世界和微觀世界的尺度鴻溝令我們的肉眼無法直接觀察到這些微觀結構，這也為學生學習和理解相關知識設下了障礙。本實驗將利用虛擬現實技術，以肺炎鏈球菌3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMGR)和當前世界上使用最廣泛的明星降血脂藥-美伐他汀為例，全面、真實、細致地讓學生了解微觀結構的獲取方法，掌握分析研究酶蛋白與抑制劑相互作用的不同手段，從而使學生能以直觀的方式觀察微觀結構，學習微觀世界。整個實驗分為三個模塊：模塊一為 X射線衍射晶體結構分析基礎；模塊二為蛋白–底物相互作用分析和操作模塊；模塊三為蛋白-抑制劑相互作用分析模塊。在本實驗教學中，學生首先學習如何將美伐他汀對接到HMGR底物活性空腔中，再運用3D互動功能尋找在分子對接計算級別下打分最高的美伐他汀結合構象與HMGR形成的氫鍵數量。但是與晶體的美伐他汀與HMGR形成的氫鍵相比，分子對接中打分最高構象與HMGR的相互作用中少了一根氫鍵，分子對接結果不夠準確。為此，學生需要進一步學習運用最新改進的高精度DOX方法，對抑制劑在酶蛋白中的結合構象進行深度優化，最終通過UNIT的3D互動功能，學生可以發現影響抑制劑的抑制活性的氫鍵網絡和關鍵藥效團明顯增加，并與晶體結構相比非常吻合。課后教師根據軟件操作的情況，結合學生撰寫的“實驗分析報告”進行綜合評分。

3.2 學生操作步驟

3.2.1 X射線衍射晶體結構分析基礎(模塊一)

衍射基礎知識學習：學生可點擊“X射線衍射基礎知識”，觀看解說動畫，學習X射線衍射法測定晶體結構的基本原理。晶體樣品放置：學習完射線衍射法測定晶體結構的基本原理后，學生可點擊“X射線單晶衍射虛擬實驗(示范)”，以CsCl晶體的X射線衍射實驗為例，學習如何在顯微鏡中觀察晶體。之后將CsCl晶體放置于X射線衍射儀上，學習調整晶體位置(圖3A)、旋轉樣品臺(圖3B)、用CCD拍攝衍射光(圖3C, D)等基本操作。

圖3 X射線衍射儀上晶體的放置、調整、旋轉及衍射光拍攝等仿真實驗圖

衍射結果處理：通過X射線衍射可得到晶胞的形狀、各原子的相對位置及相對衍射強度。之后根據上述信息進行晶體結構解析，包括通過晶胞的形狀確定晶系和點陣形式，根據原子相對位置確定其分數坐標，根據衍射強度歸屬元素符號。在示范實驗中(圖4A)，每一步均有詳細介紹，操作錯誤會收到提示(圖4B)。生成實驗報告：點擊模塊一的“實驗報告在線填寫”，將會生成該模塊的實驗目的、實驗原理以及學生在實驗操作過程中的各項操作的錯誤數和打分情況，具體如圖4(C,D)所示。對于實驗原理和實驗目的部分，我們將在課堂上會組織學生進行口頭報告和分組討論。

圖4 晶胞中各原子的相對位置和相對衍射強度的虛擬仿真操作及模塊一的實驗報告情況分析

3.2.2 蛋白–底物相互作用分析(模塊二)

蛋白晶體衍射知識學習。學生可以點擊“蛋白質X射線衍射晶體結構分析”觀看動畫，學習蛋白質晶體結構分析方法。配催化反應知識學習：HMGR/HMG-CoA復合物的結構與機理。蛋白質在生命過程中的作用無可替代，這也決定了對其性質、機理和功能的研究需要建立在其三維結構的基礎上。前述X射線衍射晶體結構分析法正是獲取蛋白質精細三維結構的主要途徑。根據X射線獲得的蛋白–配體復合物精細三維結構，學生將會發現和學習底物(HMGR-CoA)和輔因子在蛋白質(HMGR)活性空腔中進行催化反應的機制和原理。在學習中，學生開始認識到“酶催化反應的效率是由酶蛋白活性空腔中的關鍵氨基酸殘基(藥效團)來決定”，發現了蛋白–底物的相互作用主要是配體與藥效團形成氫鍵作用，并掌握了決定酶HMGR催化反應效率的關鍵藥效團。

3.2.3 蛋白–抑制劑相互作用分析(模塊三)

分子對接原理的學習：在學習了影響底物催化反應機理關鍵藥效團后，學生將在該模塊中使用目前最流行的藥物設計方法——分子對接進行HMGR抑制劑的設計。首先在“分子對接與DOX計算”子模塊中，學生可以理論學習分子對接和DOX計算的基本原理。分子對接設計HMGR抑制劑：點擊“分子對接獲取 HMGR/美伐他汀的結合模式”，學生開始嘗試將降血脂藥美伐他汀對接到HMGR酶蛋白中，并選擇HMGR的三維結構。在分子對接前需要對酶蛋白結構進行合理化的優化處理，點擊“蛋白刪除水分子”按鈕，刪除蛋白中不參與催化反應的水分子，以避免影響分子對接結果。X射線衍射無法正確分析酶蛋白中氫原子的位置，而沒有氫原子的蛋白是無法進行正確的分子對接計算的，因此在對接前必須要對沒有氫的酶蛋白進行加氫處理，點擊“蛋白和小分子加氫”對酶蛋白進行合理的加氫操作和處理。抑制劑在蛋白中的結合模式分析：點擊“提交”按鈕，對抑制劑和酶蛋白的相互作用結合構象合理性進行計算分析，學生可尋找美伐他汀在 HMGR酶蛋白中的結合位置，并結合前面底物的結合模式分析美伐他汀是否競爭性地占據HMGR底物空腔。此外，還需要從整體視角觀察HMGR酶蛋白活性空腔的形狀，并分析抑制劑小分子與HMGR活性空腔是否形狀匹配。在三維真實模式中，學生首先在分子對接的打分最高構象中，尋找美伐他汀與HMGR中的關鍵藥效團能形成的氫鍵，并手動選擇，如圖5(A, B)所示。當然，學生也可以點擊晶體中美伐他汀與HMGR中的關鍵藥效團形成的氫鍵情況。通過兩種結構模式的比較，學生可以發現，分子對接確實可以還原部分晶體結合模式，雖然有一個氫鍵在分子對接打分最高的構象中無法找到，但其實存在這樣的結合模式，只是無法正確評價并打分。

DOX計算分析HMGR與抑制劑的結合模式：點擊“DOX計算獲取HMGR/美伐他汀的結合模式”，學生可以采用高精度計算方法(DOX)優化上述結合模式，如圖5(C, D)所示。之后，觀察計算所得的新結合模式，識別主要的蛋白–抑制劑相互作用。實驗報告：在每個模塊完成后，點擊“實驗報告在線填寫”，將會生成對應模塊的實驗目的、實驗原理以及學生在實驗操作過程中的各項操作的錯誤數和打分情況。對于實驗原理和實驗目的部分，我們將會在課堂上組織學生口頭報告和分組討論實驗原理、實驗過程、實驗結果、實驗得分以及心得體會。

圖5 在HMGR空腔中抑制劑對接構象和晶體構象的差異性及DOX計算過程的虛擬仿真示意圖

4 結語

本虛擬仿真實驗項目(軟件著作權登記號為：2019SR1073615[7])已經在結構化學、分子模擬基礎以及理論與計算化學等課程中針對我校化學類專業16和17年級部分本科生嘗試開展了線上虛擬仿真實驗教學服務。在2020年春季學期COVID-19肺炎疫情防控期間，響應教育部“停課不停學”的號召，本項目除了為本校的學生提供線上自主學習服務之外，也積極面向全國高校學生免費開放使用服務。目前，國家虛擬仿真實驗教學項目共享平臺上本實驗項目瀏覽量已超過15,000人，實驗完成人數超過500人，起到了很好的線上教學示范作用。