負載多柔比星的EGFR 靶向光敏脂質體對胃癌細胞的殺傷作用研究

劉松格 谷見法 潘瓊

（鄭州市中心醫院腫瘤內科，河南 鄭州 467000）

胃癌是世界范圍內死亡率第二的惡性腫瘤，其中約90%為腺癌[1]。根據世界衛生組織統計，全球每年因胃癌死亡的人數（約700,000人）占所有惡性腫瘤死亡人數的10.4%[2]。近年來，胃癌的發病率也呈逐年上升的趨勢，全球每年約有930,000的新發病例[1,2]。

目前，手術仍然是胃癌治療的主要方法。然而，大多數患者在確診后已經處于晚期，無手術指征，對于這部分患者，化療仍然是最重要的治療手段[3]。此外，對于相當一部分行根治性胃癌切除術的患者，術前的新輔助化療及術后的輔助化療仍然發揮著重要的作用。但是，盡管許多化療藥物在臨床前實驗中能夠很好的殺傷腫瘤細胞，劇烈的毒副作用大大限制了其臨床應用[4]。

納米醫學是近年來新興的一門邊緣學科，納米藥物能夠利用腫瘤組織和正常組織在血管內皮細胞間隙上的差異，通過增強的滲透與滯留效應特異性地在腫瘤組織富集，大大提高了惡性腫瘤治療的效果并降低了治療相關的毒副作用[5-7]。目前，在常用的納米載藥體系中，脂質體的研究和應用最為成熟[5]。本研究通過薄膜水化法，制備出了一種靶向表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的紫外線反應性的脂質體，其具有較好的穩定性和組織相容性，能將負載的化療藥物靶向輸送至腫瘤組織，在體內、外研究中顯示出很強的腫瘤殺傷效應，具有廣闊的臨床應用前景。

1 材料方法

1.1 細胞培養

人胃腺癌細胞株NCI-N87（以下簡稱N87）購自美國模式培養物保藏所，保存于本實驗室。細胞用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的伯克改良伊格爾（Dulbecco modified eagle medium，DMEM）培養基（GIBCO公司）于37℃，含5% CO2的細胞培養箱內傳代培養。

1.2 主要試劑

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）購自碧云天生物技術研究所；聯乙炔基甘油磷脂酰膽堿（Diacetylenic glycerophosphatidylcholine，PC）和mal-PEG購自美國Avanti Polar Lipids公司；西妥昔單抗（Certuximab）購自羅氏制藥股份有限公司；鹽酸多柔比星（Doxorubicin，DOX）購自大連美侖生物科技有限公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）細胞增殖與活性檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所（DOJINDO）。

1.3 負載多柔比星的光敏納米脂質體的制備

1.3.1 Certuximab Fab’片段的制備及硫醇化修飾

參照Gao等人的方法[8]制備Certuximab的Fab’片段并進行硫醇化修飾。將濃度為10 g?kg-1的Certuximab與胃蛋白酶于37℃共育6 h后，用葡聚糖凝膠層析柱（Sephadex G-150 column）進行純化，將得到的Certuximab的F(ab)2片段再用木瓜蛋白酶進行水解，同樣的方法進行純化，得到抗體的Fab’片段。將Certuximab的Fab’片段與2-亞氨基噻吩（2-iminothiolane，2-IT，Sigma-Aldrich公司）按照質量比1:0.15的比例混合，室溫下輕輕振蕩反應2 h時，并用透析法除去游離的2-IT，得到硫醇化修飾的Certuximab的Fab’片段（Fab’-SH）。用同樣的方法制備硫醇化修飾的BSA（BSA-SH）。

1.3.2 負載多柔比星脂質體的制備[5,9]

稱取1.8 mgPC和0.2 mg的mal-PEG，混合溶解于氯仿與甲醛的混合溶液中（V氯仿/V甲醛=1），震蕩混勻后靜置10 min，室溫旋轉蒸發至溶劑完全揮發，使磷脂在旋蒸瓶內壁形成一層薄膜，后用含0.5 g·kg-1DOX的中性磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffered solution，PBS）溶液在旋蒸瓶中緩慢旋轉洗滌，得到負載DOX的脂質體溶液。然后將得到的脂質體溶液依次用0.8 μm、0.4 μm和0.2 μm的聚碳酸酯膜緩慢過濾，并用透析法（截留分子量MWCO: 3000 KDa）去除游離的DOX，得到粒徑均勻的脂質體。將制備的脂質體與1.3.1制備的Fab’-SH或BSA-SH于4℃反應過夜后，透析法除去游離的抗體Fab’片段或BSA，得到Fab’或BSA表面修飾的脂質體（本文中分別標記為PDF和PDB）。

1.3.3 負載多柔比星脂質體的紫外交聯

將1.3.2制備的脂質體用紫外分光光度計（Stratalinker-UV 1800）照射，以進行交聯。照射條件：紫外波長254 nm，劑量：360 g·kg-1，反應循環數：20，反應條件：4℃[10,11]。將成功制備的載藥納米脂質體與透射電鏡下觀察形態，并用動態光散射儀檢測其粒徑大小。

1.4 光敏納米脂質體的體外穩定性檢測

以含50%胎牛血清的DMEM緩沖液在體外模擬人體的血液環境，將脂質體置于其中于37℃進行孵育，不同時間點取出溶液，動態光散射儀檢測比較脂質體的粒徑大小和分散系數的變化[11]。

1.5 脂質體藥物負載DOX的釋放

取5 ml負載DOX的脂質體溶液，紫外分光光度計檢測其濃度（C1），將其置于透析膜（MWCO：3000 kDa）內，將該體系置于含有500 ml PBS緩沖液的燒杯中避光透析，分別與不同時間點取燒杯內的緩沖液300 μL，紫外分光光度計于488 nm檢測其中DOX的濃度（C2），然后按照下面的公式計算從脂質體中釋放的DOX的比例[12]：被釋放的多柔比星%=C2×500mlC1×5 ml×100%。

1.6 N87細胞對脂質體藥物的內吞能力檢測

取生長對數期的N87細胞（5×104），將其分別與濃度為1 g·kg-1的游離DOX，PDB和PDF于細胞培養箱中孵育，以不含DOX的DMEM培養基作為陰性對照組，4 h后，流式細胞術檢測N87細胞內的平均紅色熒光強度，比較細胞內DOX的含量[13]。

1.7 光敏納米脂質體對淋巴瘤細胞的體外殺傷能力檢測

將生長對數期的N87細胞置于96孔細胞培養板中培養（3000·孔-1），分別向其中加入相應濃度的游離DOX、PDB和PDF，不含DOX的DMEM培養基作為陰性對照組（NT），48 h后，向每個孔中加入CCK-8 10 μL，避光靜置2 h后，micro-plate reader（Thermo Multiskan MK3, Thermo Scientific）讀取每個孔在450 nm的吸光值（Ab），并按照如下公式計算細胞活力[14]：

其中，AbBlank為不含N87細胞的空白對照孔的吸光值。

1.8 脂質體藥物對荷瘤小鼠皮下腫瘤的抑制效果

將16只6周齡雌性BALB/c裸鼠（購自成都達碩實驗動物公司）于無菌條件下飼養至8周齡后，皮下注射1×107的N87細胞，待小鼠的皮下腫瘤生長至長徑約10 mm后，將荷瘤小鼠隨機分為四組，每組4只，分別經尾靜脈注射游離DOX、PDB和PDF，每組DOX的劑量為5 g·kg-1，尾靜脈注射等體積的PBS作為陰性對照（隔日1次×3次）。密切觀察小鼠狀態，每日測量小鼠腫瘤體積。在整個實驗周期（49 d）結束后，用頸椎脫臼發處死小鼠。所有動物實驗均經過鄭州市中心醫院倫理委員會的同意，并嚴格按照鄭州市中心醫院（大學）實驗動物章程進行操作。小鼠腫瘤體積按照Peng H等的方法進行測量和計算[15]：

1.9 統計學分析

所有數據采用SPSS11.0進行統計學分析，對于兩組均數的比較采用非配對t檢驗進行分析；對于3組及以上均數的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統計學分析，并以Dunnettt檢驗進行組間兩兩比較；對于小鼠的生存率采用log-rank法進行生存分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 EGFR靶向光敏脂質體的表征

透射電鏡下脂質體為均勻分布的球狀，且具有清晰的核殼結構，見圖1。動態光散射結果顯示見表1，在經過紫外線交聯后，脂質體的直徑為從117.2±28.5 nm下降至82.3±10.3 nm，脂質體溶液的多分散系數（Polydispersity index，PDI）從0.14下降至0.09，說明經過紫外交聯后的脂質體，具有更加緊密和均一的結構。此外，紫外分光光度計檢測結果顯示本研究制備的溶液中DOX的終濃度為0.20 g·kg-1，而載體的濃度為0.91 g·kg-1，據此可計算出本研究制備的脂質體藥物，其載藥量約為21.98%，包封率為40%。

圖1 透射電鏡觀察光敏脂質體的顯微形態

表1 光敏脂質體交聯前后粒徑變化

2.2 紫外交聯能顯著提高光敏脂質體的穩定性

將脂質體在模擬人體血液環境中孵育24 h后，交聯后的脂質體，其粒徑大小及分布的變化比未交聯的脂質體顯著減小、穩定性提高，見表2。

表2 紫外交聯前后光敏脂質體的穩定性比較

2.4 紫外交聯不會影響脂質體內藥物的釋放

在48 h和72 h后，交聯后的脂質體能分別將釋放約69.5%和77.3%的DOX，而未交聯的脂質體則分別能將約82.8%和89.7%的DOX釋放出來，見圖2。可見，紫外交聯可以降低脂質體內藥物的釋放，由于>70%的藥物在48 h后能夠成功從脂質體中釋放出來，因此這種藥物的緩釋并不會對其負載的化療藥物的細胞毒作用造成顯著的負面影響。

圖2 紫外交聯前后，脂質體負載DOX 的釋放情況比較

2.5 靶向光敏脂質體能增強細胞對藥物的攝取

流式細胞術結果顯示，脂質體藥物孵育后，N87細胞內的紅色平均熒光強度較游離藥物組有顯著增強（P<0.05），而相比之下，PDF組N87細胞內的熒光強度較PDB組增加更多（P<0.05），見圖3。

圖3 流式細胞術檢測腫瘤細胞對脂質體藥物內吞能力檢測

2.6 脂質體能夠顯著增強藥物對細胞的殺傷效果

在各個治療濃度下，PDF治療組N87細胞的細胞活力較游離DOX治療組及PDB治療組顯著下降，PDF對N87細胞的半數抑制濃度（Half inhibitory concentration，IC50）較PDB及游離DOX有顯著降低（P<0.05），見圖4。

圖4 游離DOX 及脂質體藥物對N87 細胞體外殺傷能力比較

2.7 靶向光敏脂質體能夠顯著抑制荷瘤小鼠皮下腫瘤生長

與PBS對照組相比，游離DOX治療組能夠輕度一直荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長，PDB能顯著抑制荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長，而相比之下，PDF對小鼠皮下腫瘤的抑制能力較PDB和游離DOX更強（P<0.05），見圖5。

圖5 靶向脂質體能夠顯著抑制荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長

3 討論

化療是臨床上惡性腫瘤治療的主要手段之一，其在惡性腫瘤的術前新輔助化療、術后輔助化療以及晚期的姑息治療中發揮著越來越重要的作用。然而，化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常組織和細胞有很強的毒副作用，這大大限制了其臨床應用[16,17]。近年來，納米醫學的發展，為解決化療藥物的高毒性問題提供了新的有效方法。研究表明，正常組織內，血管內皮細胞的間隙一般＜7 nm，而腫瘤組織內由于血管異型增生，其內皮細胞間隙增大，約為200-700 nm。因此，粒徑在數十到數百納米之間的納米藥物可以通過腫瘤組織的內皮細胞間隙，但卻不能通過正常組織的內皮細胞間隙，使得其能夠在腫瘤組織內部特異性富集，這種效應被稱之為增強的滲透與滯留效應[18]。納米藥物的這種效應，使得其在腫瘤治療領域得到了越來越廣泛的應用。

研究表明，納米藥物的穩定性是影響其療效的主要因素之一[9,12]。為了增強納米載藥體系的穩定性，本研究利用PC成功制備出一種對紫外線敏感的脂質體。PC是一種二炔磷脂，其分子中的兩個炔基在紫外線照射后可以在兩個分子之間形成共價鍵連接，這使得脂質體的脂質雙分子層之間的連接更加緊密，這種緊密的連接大大增強了脂質體的穩定性[9,12]。本研究的研究結果顯示，經過交聯后的脂質體，在體外模擬血液環境中的穩定性較未交聯的脂質體有顯著的提升。

為增強脂質體的靶向性，本研究用靶向EGFR抗體Certuximab的Fab’片段對脂質體的表面進行了的修飾。結果表明，與游離藥物相比，脂質體藥物能顯著提高腫瘤細胞對藥物的攝取，增強負載化療藥物對胃癌細胞的毒性，而Fab’片段的靶向修飾則進一步提高了腫瘤細胞內的藥物濃度和毒性。體外實驗中我們得到了與體內實驗相一致的實驗結果。靶向脂質體的這種較強的體內外腫瘤殺傷效應主要是由于下原因：（1）脂質體藥物的穩定的球狀結構增強了腫瘤細胞的攝取；（2）納米藥物通過高滲透長滯留效應，增強了在腫瘤組織內部的富集；（3）抗體Fab’片段的表面修飾，使脂質體藥物通過抗原-抗體的識別和結合，進一步增強了其在腫瘤組織內部的富集以及腫瘤細胞對脂質體藥物的攝取。

綜上所述，本研究制備的靶向EGFR的光敏脂質體，擁有很好的穩定性，在體內、外研究中顯示出很強的非霍奇金淋巴瘤殺傷效果，具有廣闊的臨床應用前景。