電針對于焦慮大鼠模型HPA 功能水平變化的影響

童秋瑜 沈衛(wèi)東 王 劍

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院針灸科，上海 201203

焦慮障礙嚴重影響患者生活質量，針灸對緩解其有明確療效，但作用機制尚不清楚。內源性大麻素系統(tǒng)在應激焦慮發(fā)生中起重要作用，海馬有高密度表達的大麻素受體下丘腦-垂體-腎上腺皮質（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）軸是人體應激反應的關鍵通路,其活動受海馬精細調控。目前公認的機制是HPA軸功能持續(xù)亢進，體內糖皮質激素（glucocorticoid，GC）水平過度升高，從而導致相應部位的病理損傷。因此推測：海馬內源性大麻素系統(tǒng)調控HPA 軸在電針治療應激所致焦慮障礙中發(fā)揮重要作用。本研究探討電針作用后海馬內源性大麻素系統(tǒng)變化，闡明其對HPA軸相關神經(jīng)內分泌因子和受體的調節(jié)以及在電針緩解應激所致焦慮行為改變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采取4～8 周的雌性SD 大鼠，SPF 級（合格證編號：20180004019270），體重200～220 g，每只籠位飼養(yǎng)4～6 只大鼠，按照國家部屬實驗動物管理委員會制訂的標準飼養(yǎng)，動物房溫度23～25°C，相對濕度40%～50%，光照時間7∶00～19∶00；所有大鼠均都經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學實驗動物管理機構的許可，并遵循了上海中醫(yī)藥大學所制訂的有關實驗動物保護和使用的指南。

1.2 主要試劑及耗材

AM-251（MCE 生產(chǎn)，貨號：HY-15443）；針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司，0.35 mm×13 mm）；促腎上腺皮質激素（ACTH）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，MM-0565R1）；皮質醇（CORT）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，MM-0559R1）；促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，MM-0520R1）；糖皮質激素（GC）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司生產(chǎn)，MM-0986R1）。

1.3 實驗儀器或器械

大鼠自發(fā)活動箱（上海昆盟生物科技有限公司）；高架十字迷宮（上海昆盟生物科技有限公司）；束縛裝置（上海昆盟生物科技有限公司）；電針儀（上海華誼醫(yī)用儀器，BT701-1B）；全波長酶標儀（Thermo，multiskan GO）；全自動雪花制冰機（常熟雪科，MS-20）；超低溫冷凍儲存箱（美菱，DW-HL528S）。

1.4 實驗方法

1.4.1 建立大鼠焦慮模型 采用單次延長應激法建立術前焦慮模型[1]，大鼠束縛2 h 后強迫游泳20 min，最后把大鼠放回籠位。具體簡述如下：①取直徑4 cm 的PVC 管（以不影響大鼠呼吸同時使之無法自由活動身體為準），截為40 cm 長的一段，一端封堵但保持透氣，待大鼠放入后封閉另一端，靜置保持2 h；②強迫游泳裝置為一個直徑80 cm 水池，水深50 cm，水面距水池上緣35 cm；強迫游泳20 min。③結束強迫游泳的大鼠用毛巾擦拭后，再以電吹風吹干毛發(fā)，休息15 min后，吸入異氟烷麻醉至意識消失放回籠內令其自然蘇醒。通過評估曠場實驗中大鼠邊緣區(qū)域運動時間延長及高架十字迷宮實驗開放臂停留時間降低來判斷大鼠是否存在焦慮樣行為。

1.4.2 實驗動物分組與干預方法 具體分組如下（每組12 只）。對照組（正常飼養(yǎng)不做處理）；模型組（單次延長應激法焦慮模型）；假電針組（穴位附近刺淺表，留針不通電）；電針組（針刺百會、神門、內關、印堂，2 Hz，1 mA，持續(xù)15 min）；E：AM251（1 mg/kg 體重，針刺前30 min 腹腔注射）+電針組（穴位同電針組）；F：AM251+假電針組（方法同假電針組）。造模結束后的次日，開始對大鼠進行針灸及藥物干預。對于針灸組的大鼠，主要參照《實驗針灸學實驗指導》和《大鼠穴位圖譜的研制》[2]，選取百會、神門、內關、印堂四穴，以“華佗牌”一次性針灸用針（針徑0.35 mm，長13 mm）進行針刺，定位及針刺方法如下。百會穴：頂骨正中，向后斜刺2 mm；神門穴：前肢內側腕部橫紋尺骨邊緣，直刺1 mm；內關穴：前肢內側，距腕關節(jié)約3 mm 尺橈骨縫間，直刺1 mm；印堂穴：雙眼之間中點向上約3 mm，向后斜刺2 mm。進針后連接電針治療儀，設置2 Hz頻率連續(xù)波刺激，電流強度1 mA，留針15 min，每天1 次，干預時間為3 d。對于假針刺組，于穴位附近刺淺表，留針不通電。對于AM251 干預組，每天于針刺前30 min，按照1 mg/kg 體重的劑量腹腔注射，其他各組注射等體積的生理鹽水；AM251 是選擇性大麻素1（CB1）受體拮抗劑

1.4.3 行為學檢測 ①曠場實驗（open field test）。針灸干預3 次后的次日進行曠場試驗。觀察指標：通過觀察大鼠爬行中央格次數(shù)與時間、外周格次數(shù)與時間以及運動的總距離，計算出爬行的總格數(shù)、中央格爬行次數(shù)占爬行總格數(shù)的比例以及中央格停留時間占總時間的百分比[3]。大鼠三爪以上跨入鄰格才能計數(shù)。曠場實驗專用活動箱由不反光的黑色亞克力材料制成，l00 cm×100 cm×40 cm（長×寬×高），底板25 個20 cm×20 cm 方格，四周16 個方格為外周格，剩下的9 個方格為中央格，將大鼠放在中央格，觀察5 min 內活動情況。在測試實驗時保證整個環(huán)境安靜無干擾。記錄并分析數(shù)據(jù)，通過評估中央格爬行次數(shù)及停留時間來推測大鼠的焦慮樣行為。每次實驗后用75%酒精對曠場裝置進行清理，消除異味。②高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）。EPM 實驗將大鼠輕輕放至迷宮的中心區(qū)域，使之面向開放臂，記錄大鼠6 min 內的探索活動。觀察指標：大鼠進入開放臂次數(shù)及停留時間、閉合臂次數(shù)及停留時間[4]。實驗裝置由不反光的黑色亞克力材料制成，具體為兩個閉合臂（50 cm×10 cm×40 cm），兩個開放臂（50 cm×10 cm）及中心區(qū)域（10 cm×10 cm）連接而成，離地面約70 cm高。每只大鼠測試結束后，用75%酒精棉片擦拭實驗裝置以去除殘留的氣味。③ELISA 檢測。使用試劑盒進行檢測，所有步驟按說明書操作。測試完成后分別根據(jù)標準曲線，求出各組大鼠血漿中各值含量并進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Graph Pad 7 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖片數(shù)據(jù)處理。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 法。計數(shù)資料以例數(shù)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電針對單次延長應激法大鼠模型焦慮行為發(fā)生的影響

通過曠場實驗及高架十字迷宮實驗評估大鼠焦慮行為，相對于對照組，模型組大鼠邊緣區(qū)域運動時間延長，開放臂停留時間縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，電針組中可見邊緣區(qū)域運動時間縮短而開放臂停留時間明顯延長（P ＜0.05）。與電針組比較，假電針組、AM251+電針組大鼠邊緣區(qū)域運動時間延長，開放臂停留時間縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 電針對單次延長應激法大鼠模型焦慮行為發(fā)生的影響

2.2 電針對HPA 軸減輕焦慮的調控

相對于對照組，模型組血清ACTH、CORT、CRH、GC 蛋白釋放明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，電針組可以明顯抑制上述蛋白在血清中表達，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與電針組比較，假電針組、AM251+電針組血清ACTH、CORT、CRH、GC 蛋白釋放明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見圖2。

3 討論

3.1 中醫(yī)針灸在治療創(chuàng)傷后應激所致焦慮障礙具有獨特的優(yōu)勢

應激是指大腦在應對確定事件或環(huán)境時所表現(xiàn)出來的反應，慢性應激會產(chǎn)生一些有害的影響[5]。由于抗焦慮藥物存在著許多的副作用或不良反應，限制了這些藥物在臨床上的廣泛使用[6]。在西醫(yī)治療中的非藥物療法主要以心理療法為主[7]。因此，開發(fā)新穎有效的治療焦慮癥方法已成為重要的醫(yī)學和社會課題。

中醫(yī)針灸可以緩解焦慮障礙改善焦慮情緒，尤其是對軀體癥狀[8]。目前，電針療法應用于焦慮的治療最為廣泛[9]。本研究結果提示，電針具有很好減輕焦慮發(fā)生。因此需要進一步探討針灸是如何減輕創(chuàng)傷后應激所致焦慮。

3.2 中醫(yī)針灸激活海馬內源性大麻素系統(tǒng)（eCB）減輕焦慮機制

圖2 電針對HPA 軸減輕焦慮的調控

中醫(yī)按照病情癥狀，將焦慮癥歸屬于情志病的范疇[10]。內源性大麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要結合突觸前膜上的大麻素Ⅰ型受體（cannabinoid 1 receptor，CB1R）[11]，可抑制神經(jīng)遞質的釋放[12]。AM251 是CB1應用最為廣泛的受體拮抗劑。在杏仁核內，在糖皮質激素促進內源性大麻素的釋放同時，大麻素亦可以通過HPA 軸調控局部和遠端糖皮質激素的分泌[13]。CB1R 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布。杏仁核-海馬是調控情緒反應行為的關鍵區(qū)域，其內的CB1R 密度含量最高[14]。使用CB1R 拮抗劑治療疾病可能破壞內源性大麻素系統(tǒng)功能，導致患者出現(xiàn)抑郁、焦慮樣行為或癥狀[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)電針刺激大鼠百會穴可調節(jié)海馬上內源性大麻素受體CB1 的表達，提高內源性大麻素分解酶和合成酶的活性[16]。CB1 信號通路活化可產(chǎn)生針灸治療時的相同生物學效應[17]。電針刺激的神經(jīng)保護作用可被內源性大麻素受體拮抗劑阻斷[18]。電針反復來刺激小鼠的百會穴通過CB1 受體能夠產(chǎn)生明顯的止痛效果[19]。AM251 可抑制電針刺激后大鼠CB1 受體的高表達，導致電針的鎮(zhèn)痛作用減弱[20]。

3.3 HPA 軸在針刺治療焦慮的作用

本研究通過ELISA 觀察HPA 軸變化，主要通過測得血清中ACTH、CORT、CRH、GC 含量來反映出單次延長應激對成年老鼠HPA 軸的影響以及電針是否可以減輕其釋放，阻斷電針調配受體是否可以干預電針對HPA 軸的影響。HPA 軸是機體應激反應過程的中樞，CRH、ACTH、CORT 三者在HPA 軸上相互關聯(lián)、相互影響。人體受到應激刺激時，CRH 可隨著門脈系統(tǒng)的血液進入后垂體前葉，作用于垂體前葉使其釋放ACTH，導致CORT 的分泌增加[21]。海馬是應激損傷的敏感區(qū)及HPA 軸應激反應鏈上的高位負反饋調節(jié)中樞，可抑制HPA 軸的應激反應，并將HPA 軸在應激下的亢進功能恢復到正常水平[22]。HPA 軸活性與內源性大麻素系統(tǒng)緊密有關。內源性大麻素通過與突觸前軸突末端的CB1 結合抑制γ-氨基丁酸及谷氨酸鹽的釋放。當缺失CB1 或使用受體拮抗劑后，ACTH 水平升高，糖皮質激素分泌增多。大麻素通過抑制下丘腦室旁核CRH 分泌性神經(jīng)元谷氨酸鹽的傳入，減少CRH 的分泌，從而抑制HPA 軸所產(chǎn)生的應激反應[23]。HPA 軸興奮，GC 分泌增多是應激最主要的神經(jīng)內分泌反應之一。當過度應激，HPA 軸過度激活，高濃度的GC 可引起海馬神經(jīng)元變性和損傷，提示GC 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的此類損傷很可能是心理應激導致精神損傷的機制之一[24]。針刺可能引起HPA軸功能改變。電針神門、三陰交可降低心理應激失眠大鼠CRH、ACTH、CORT 水平，而申脈、照海穴可調節(jié)HPA 軸上相關激素的釋放或分泌，來治療失眠[25]。以上研究提示，HPA軸是機體應激反應的主要通路，與內源性大麻素系統(tǒng)和針刺存在著緊密聯(lián)系。本研究顯示，HPA 軸的活化跟焦慮密切相關，其分泌的激素ACTH、CORT、CRH、GC 在某種方面導致焦慮發(fā)生，而電針通過CB1 受體調控HPA 軸抑制激素分泌減輕焦慮。

本研究探討電針作用后海馬內源性大麻素系統(tǒng)變化，通過構建單次刺激大鼠模型，采用曠場實驗及高架十字迷宮實驗行為學試驗檢測大鼠術后焦慮變化，并對其分泌蛋白的表達水平進行檢測，證明了此通路在大鼠焦慮發(fā)生中的重要作用。本研究下一步繼續(xù)擴大實驗樣本量，加深機制方面研究，深入探討電針減輕焦慮的機制。