CRISPR/Cas9介導的綿羊示蹤臍帶間充質干細胞系的建立

李松美，仇雨歌，陳勝男，王曉萌，王春生

CRISPR/Cas9介導的綿羊示蹤臍帶間充質干細胞系的建立

李松美，仇雨歌，陳勝男，王曉萌，王春生

東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040

【】利用CRISPR/Cas9技術建立綿羊示蹤臍帶間充質干細胞系，為間充質干細胞的臨床治療與分化機制研究奠定基礎。根據綿羊ROSA26的基因組序列，利用在線工具ZiFiT Targeter Version 4.2設計合成3對引物，利用點突變法，以px330質粒為模板分別進行PCR，DpnⅠ去除質粒DNA后，PCR產物自身環化，酶切測序鑒定，構建以綿羊Rosa26為靶標基因的sgRNA/Cas9載體，構建的質粒含Cas9和向導RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表達盒，由U6啟動子驅動表達。將上述載體分別利用脂質體轉染綿羊臍帶間充質干細胞(sUMSCs)，提取其基因組PCR后進行T7E1酶切，瓊脂糖電泳分析條帶灰度以檢測載體編輯活性。根據sgRNA序列在綿羊ROSA26靶位點的上下游設計并合成左、右同源臂擴增引物，提取綿羊全基因組為模板分別進行PCR擴增得到左右同源臂，回收純化后分別與pMD19-Simple連接，酶切測序鑒定獲得左、右同源臂重組質粒。根據PCR引入的酶切位點，將左同源臂質粒和Donor表達載體DC-DON-SH02 ROSA26進行酶切連接，鑒定獲得左臂重組打靶載體，使用相同方法將右同源臂質粒連接到左臂打靶載體上，鑒定獲得Donor打靶載體，載體攜帶嘌呤霉素抗性基因和綠色熒光蛋白（GFP）報告基因。在生長良好的sUMSCs中加入不同濃度的嘌呤霉素，觀察細胞存活時間，確定最佳抗性篩選濃度和時間。利用脂質體共轉sgRNA/Cas9載體和Donor載體到綿羊間充質干細胞，在其ROSA26位點切割DNA雙鏈，在DNA斷裂處通過同源重組方式引入報告基因，轉染48 h后進行嘌呤霉素抗性篩選，篩選結束后更換正常培養基繼續培養，觀察綠色熒光的表達并提取陽性細胞基因組，針對ROSA26位點設計上下游兩對引物對其進行PCR檢測其整合情況。（1）針對綿羊Rosa26位點設計3對PCR引物，利用點突變法將sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位點上，成功構建sgRNA/Cas9載體px330-sgRNA1/2/3，將其分別轉染sUMSCs，T7E1酶切結果表明px330-sgRNA2/3出現脫靶現象，未在靶位點發生編輯，px330-sgRNA1的編輯效率最高，約為20%；（2）基于sgRNA1，PCR法獲得打靶載體的左、右同源臂，經一系列分子生物學方法先后連接到載體DC-DON-SH02 ROSA26上，經酶切和PCR鑒定，成功獲得綿羊ROSA26位點的重組載體sROSA26-HA；（3）篩選得到sUMSCs最佳抗性濃度時間，利用Lipofectamine2000共轉染sgRNA/Cas9載體和Donor重組載體到sUMSCs，1.5 μg·mL-1嘌呤霉素篩選15d至對照組細胞全部死亡，獲得的陽性克隆并擴大培養。顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光，且與對照組相比，陽性細胞克隆的基因組PCR均檢測到特異條帶，表明sUMSCs的ROSA26位點發生同源重組，GFP基因被成功敲入到基因組中并能正常表達，該細胞可以用于動物疾病模型中追蹤sUMSCs的去向和分化方向的研究。成功利用CRISPR/Cas9系統在sUMSCs內實現外源GFP基因的定點敲入，獲得綿羊示蹤臍帶間充質干細胞系，為間充質干細胞進一步的臨床轉化奠定了基礎。

綿羊；CRISPR/Cas9；同源重組；sUMSCs；GFP；ROSA26

0 引言

【研究意義】間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種來源于中胚層的具有自我復制和多向分化潛能的成體干細胞。由于被移植到體內的MSC具有可以向特定或病損的組織或器官定向遷移并分化為特定細胞來修復損傷的特點，其在臨床治療應用方面具有巨大潛力。但MSCs移植至宿主體內時存在時間非常短暫，難于檢測到其作用軌跡和分化渠道，無法研究MSCs解決損傷的臨床前和臨床機制，如何實現MSCs位置標記成為開展此研究的關鍵點。新的技術如CRISPR/Cas9系統對DNA分子具有靶向切割的特性已經實現了外源基因向特定細胞基因組中的有效插入，為此開辟了一條新路徑。利用CRISPR/ Cas9技術將外源GFP基因敲入sUMSCs，建立穩定的細胞系，通過檢測GFP示蹤MSCs去向和分化為何種細胞，此舉為揭示MSCs在損傷修復中的作用奠定基礎。【前人研究進展】從2010年至今，陸續出現的鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs），及規律成簇的間隔短回文重復（CRISPR）等新型基因組編輯技術不僅大大降低了對動物進行基因敲除、修飾的難度，而且使動物轉基因技術由傳統的隨機整合發展到高度精確的基因組定向刪除、突變或插入等精確修飾改造[1]。CRISPR系統，通過Cas蛋白與CRISPR轉錄出來的RNA形成蛋白質核酸復合物行使免疫功能。CRISPR/Cas9系統是II型CRISPR／Cas系統，具有核酸內切酶功能，能選擇性切割DNA序列，是一種基因編輯的革命性技術[2]。利用CRISPR/Cas9系統可以進行精確的基因操作實現特定細胞的遺傳操作[3]，此技術主要利用sgRNA引導內切酶定點切割DNA雙鏈（DSBs），并在DNA斷裂處將供體DNA上的序列與DSB兩側同源通過同源重組和非同源重組方式進行修復將目的序列引入基因組，實現基因敲入，既避免了細胞DNA降解，又維護了細胞的正常功能[4]。相較于ZFNs、TALENs，CRISPR/Cas9系統，因其具有可以定點打靶基因、編輯效率高、操作方便等特點已廣泛應用于大小鼠、斑馬魚、猴和豬等轉基因動物制備和基因功能等研究領域[5-8]。選擇“ROSA26”位點用于GFP基因安全敲入，是因為該位點適應于外源基因良性插入并能保證轉入基因的正常穩定表達，該位點的基因敲入對細胞功能及動物的健康無副作用，且在胚胎和其他成體組織中都有所表達。該位點現已成為外源基因插入的重要位點[9]。間充質干細胞具有低免疫原性、多向分化、向病損組織定向遷移和免疫調節等優點，其來源廣泛、獲取簡單且無倫理性爭議，決定了其在疾病治療和組織損傷修復等方面具有廣闊的應用前景[10]。從臨床數據可知，MSCs在骨與軟骨疾病、脊髓損傷、移植排斥、肝臟疾病、自身免疫病和心血管疾病等方面具有一定的臨床治療效果[10]。例如，MSCs可以通過旁分泌營養介質，可以抑制缺血導致的凋亡[11]、抑制瘢痕形成、刺激血管新生和維持血管穩定性[12]，對心腦血管疾病方面具有一定的改善作用。MSCs容易受趨化因子和生長因子的介導，向損傷或炎癥部位定向遷移, 促進組織損傷修復[13]。MSCs還具有直接分化為成骨和軟骨等能力，能直接替代損傷細胞從而在骨與軟骨損傷的修復中發揮重要作用[14]。MSCs在動物試驗中顯現出顯著的神經保護作用，能減少神經細胞凋亡，改善新生兒缺氧缺血性腦病帶來的損傷[15]。MSCs可對參與特異性和非特異性免疫應答的多種細胞發揮免疫調節作用。自體MSCs可通過影響促炎性細胞因子抑制淋巴細胞在有絲分裂原或抗體活化反應中的增殖[16]，也可通過抑制淋巴細胞分泌炎癥因子調節免疫[17]。利用異體的MSCs與常規藥物相結合的治療方法，可明顯改善類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis, RA）患者的臨床指標[18]和難治性系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）患者的腎功能，使臨床緩解率顯著上升[19]，可見MSCs對自身免疫性疾病有一定的改善作用。MSCs還可以介導宿主的防御反應以抵抗病毒和寄生蟲等微生物的感染，有望降低感染者的發病率和死亡率[20]。【本研究切入點】迄今尚未見到CRISPR/Cas9介導同源重組外源報告基因GFP于sUMSCs 的ROSA26位點來建立綿羊示蹤臍帶MSCs細胞系的報道。本研究以CRISPR/Cas9技術為基礎，針對綿羊ROSA26位點設計sgRNA，構建了sgRNA/Cas9同源打靶載體，用脂質體轉染該載體定點打靶綿羊MSCs，建立CRISPR/Cas9介導外源GFP基因敲入綿羊MSCs細胞系，獲得具有綠色熒光的陽性克隆細胞系以供后續研究。【擬解決的關鍵問題】構建針對綿羊ROSA26位點的sgRNA/Cas9表達載體，轉染檢測活性，連接左右同源臂以獲得綿羊同源打靶載體，然后利用脂質體轉染綿羊MSCs，在綿羊MSCs中建立利用CRISPR/Cas9技術敲入外源GFP基因的示蹤細胞系，為進一步研究綿羊間充質干細胞的功能和分化機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年9月至2019年5月在東北林業大學動物胚胎發育實驗室完成。pMD19-T simple購自寶生物工程（大連）有限公司，sUMSCs和載體px330由東北林業大學生命科學學院動物胚胎發育實驗室鑒定與保存，試驗過程所用引物與測序分析由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 綿羊ROSA26基因sgRNA/Cas9表達載體的構建

根據綿羊Rosa26的基因序列分別設計3條正向引物和通用反向引物，利用點突變法（KOD-Plus- Mutagenesis Kit，Toyobo Life Science Department）構建綿羊ROSA26基因sgRNA/Cas9表達載體：以px330為模板，以KOD-R，sROSA26-sgRNA1、2、3（表1）為引物分別進行PCR擴增，用DpnⅠ對PCR產物進行消化（去除質粒DNA），隨后進行PCR產物自身連接，Trans5α轉化并挑取單克隆，堿裂解法小提質粒（高純質粒小量制備試劑盒 BioTeke）。對突變質粒克隆載體進行Ⅰ酶切鑒定及測序分析，測序正確的重組質粒分別命名為px330-sgRNA1/2/3，并利用試劑盒（Endo-free Plasmid Mini KitⅡ, OMEGA）提取無內毒素質粒用于后續試驗。

1.3 綿羊ROSA26基因sgRNA/Cas9表達載體的活性檢測

利用Thermo GeneJET Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取綿羊臍帶間充質干細胞(sUMSCs)全基因組：培養收集適量sUMSCs，裂解細胞，去除蛋白，洗脫獲得純化基因組，以sUMSCs全基因組作為對照，用px330-sgRNA1/2/3分別轉染bMSCs，轉染48—72 h后，提取其全基因組。根據綿羊ROSA26基因打靶位點和sgRNA序列在1 402 bp和1 910 bp處設計PCR上下游引物px330-TP-F和px330-TP-R，利用LA酶以綿羊基因組或轉染后UMSC基因組DNA為模板進行PCR擴增。對PCR膠回收產物（康為世紀Gel Extraction Kit試劑盒）進行變性退火雜交，T7E1酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 綿羊ROSA26同源打靶載體的構建

提取綿羊全基因組，根據sgRNA序列在綿羊ROSA26靶位點的上下游設計并合成左同源臂擴增引物sROSA26-LHA-F、sROSA26-LHA-R（長度1 093 bp，具有Ⅰ、Ⅰ酶切位點）和右同源臂擴增引物sROSA26-RHA-F、sROSA26-RHA-R（長度928bp，具有GⅠ、Ⅰ酶切位點）。以綿羊基因組DNA為模板，左臂以sROSA26-LHA-F和sROSA26-LHA-R為引物，右臂以sROSA26-RHA-F和sROSA26-RHA-R為引物，使用Ex Taq酶進行大量擴增，反應條件為：預變性94℃ 5min；94℃ 30s，52℃、55℃、58℃各1min，72℃ 7min，33循環；72℃延伸7min。PCR產物膠回收后與pMD19-Simple克隆載體連接。轉化DH-5α、挑取單克隆、保存菌種、質粒小提。對右臂重組克隆載體進行Ⅰ、GⅠ雙酶切鑒定；對左臂重組克隆載體進行Ⅰ酶切鑒定。經酶切鑒定正確的左、右同源臂重組質粒且測序分析正確命名為sROSA26-LHA -pMD19和sROSA26-RHA-pMD19。將sROSA26- LHA-pMD19-T和Donor表達載體DC-DON-SH02 ROSA26分別進行Ⅰ和Ⅰ大量酶切并進行膠回收，連接所需目的基因片段、轉化、挑取單克隆、保存菌種及質粒小提，對左臂重組表達載體進行Ⅰ單酶雙酶切鑒定，酶切鑒定準確的左臂重組表達載體測序對比分析。準確的重組表達載體命名為sROSA26-LHA。將sROSA26- RHA-pMD19-T和sROSA26-LHA分別進行Ⅰ和Ⅰ大量酶切并進行膠回收來獲取目的片段。T4連接左右同源臂、轉化、挑取單克隆、保存菌種及質粒小提，對重組表達載體進行dⅢ單酶雙酶切鑒定。對酶切鑒定正確的載體進行測序分析。正確的打靶載體命名為sROSA26-HA，無內毒素質粒提取用于后續試驗。

1.5 陽性細胞克隆篩選和同源重組檢測

取生長良好的sUMSCs，觀察加入不同濃度的嘌呤霉素的細胞存活時間，確定最佳抗性篩選濃度。利用Lipofectamine2000（Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent，Thermo Fisher）轉染sUMSCs，24 h后，根據sROSA26-HA表達的綠色熒光確定轉染效率并收集細胞。根據sROSA26-HA載體攜帶有嘌呤霉素抗性基因的特點，轉染48h后進行嘌呤霉素抗性篩選，在對照組細胞幾乎全部死亡時，更換無嘌呤霉素的DMEM/F12合成培養基培養以擴大培養篩選得到的陽性細胞。提取其全基因組，根據綿羊ROSA26位點插入的片段序列設計同源重組檢測引物，以提取純化后的陽性細胞基因組為模板，上游以SRL-F和SRL-R為引物，下游以SRR-F和SRR-R為引物，利用Ex Taq酶進行同源重組PCR鑒定，反應條件為：預變性98℃ 5 min；98℃ 10s，58℃ 30s，72℃ 1 min，33循環；72℃延伸7 min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 px330-sgRNA載體的構建與切割活性檢測

針對綿羊Rosa26位點設計3條正向PCR引物px330-sgRNA-1/2/3和1條通用反向引物分別進行PCR擴增。利用Ⅰ酶切去除質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示在大于8 000 bp處看到單一條帶，獲得PCR產物。利用PCR產物自身環化反應得到重組突變表達載體，因為與原載體相比，重組質粒的Ⅰ酶切位點發生突變，不能被切開。使用Ⅰ進行酶切鑒定，跑膠驗證未被切開的重組質粒初步斷定為正確的sgRNA/Cas9表達載體（圖1），測序結果正確的載體命名為sROSA26-sgRNA1。（sROSA26- sgRNA1效率最高，故本試驗只表述sROSA26-sgRNA1結果）。

sUMSCs匯合度達到70%—80%時（圖2-A），脂質體轉染sROSA26-sgRNA-1/2/3載體，對照組轉染pAcGFP1-N1載體，48 h后，觀察細胞狀態和熒光強度（圖2-B），根據對照組，轉染效率為40%左右（圖2-C）。以px330-TP-F和px330-TP-R為引物對轉染后細胞基因組PCR后，電泳檢測，對照組和轉染組均在約500 bp處檢測到單一條帶。對該PCR產物分別進行T7E1酶切檢測堿基錯配情況。結果表明，與對照組相比，sg1轉染組的PCR產物能夠被T7E1切割為大小132 bp和377 bp兩條帶（圖3）。根據公式突變率=突變型/（野生型+突變型）計算編輯效率約為20%，但是sg2和3的PCR產物未被T7E1切開。

A：sUMSCs；B：轉染后sUMSCs；C：對照組sUMSCs（50×）

（A：在sUMSCs細胞系中轉染空載作為陽性對照；B、C：在sUMSCs細胞系中trim away技術，轉入帶有GFP的sROSA26-sgRNA-1/2/3載體，轉染48h后的亮視野和暗視野，根據觀察到的熒光強度確定轉染效率）

A：sUMSCs；B：sUMSCs After transfecion；C：control group sUMSCs（50×）

(A: the sUMSCs cell line after transfecting empty plasmid as a positive control; B, C:Transfer sROSA26-sgRN-1/2/3 vectors with GFP into sUMSCs cell lines using Trim Away technique, capture the bright and dark field after transfection for 48h, and the transfection efficiency was determined according to the observed fluorescence intensity.)

圖2 轉染效率

Fig. 2 Transfection efficiency

1：Trans2K DNA Marker；2：野生型PCR產物；3：野生型T7E1酶切產物；4：突變型T7E1酶切產物

2.2 綿羊ROSA26左右同源臂表達載體構建

以上述編輯效率最高的sgRNA1的切割位點為中心，設計敲入載體的左、右同源臂引物，以綿羊基因組為模板分別擴增。電泳結果顯示，在約1 100 bp和900 bp處檢測到特異性單一條帶，與理論值相符（圖4、5）。將上述PCR產物分別與克隆載體pMD19- Simple連接，利用PCR和酶切對重組質粒進行鑒定。PCR結果顯示，左、右同源臂分別在約1 100 bp和900 bp處檢測到特異單一條帶。含有同源左臂的重組質粒經PstⅠ酶切后，檢測到與理論值相符的兩個條帶，大小為732 bp和3 200 bp（圖6）；右臂克隆載體經Ⅰ和GⅠ雙酶切后，檢測到與理論值相符的兩個條帶，大小為928 bp和1 693 bp（圖7）。經測序進一步鑒定后分別命名為pMD19- LHA和pMD19-RHA。隨后經一系列分子生物學步驟將左右同源臂先后連接到表達載體，對左同源臂重組表達載體和重組表達載體進行PCR和Ⅰ、dⅢ酶切鑒定。PCR鑒定電泳檢測顯示：分別在約為1 100 bp和900 bp大小處檢測到特異性單一條帶，Ⅰ酶切檢測到大小約為700 bp和8 200 bp的兩個片段（圖8）；dⅢ酶切割后，檢測到大小約為2 400 bp和5 800 bp的兩個片段，均與理論相符，表明成功將左右同源臂連入表達載體，將測序正確的同源重組載體命名sROSA26-HA（圖9）（構建過程和所用載體圖譜如圖10、11所示）。

1：左臂PCR產物；2：Trans8K DNA Marker

1：右臂PCR產物；2：Trans8K DNA Marker

1：D2000Plus DNA Marker；2：左臂克隆載體PstⅠ酶切鑒定

1：右臂克隆載體雙酶切鑒定；2：Trans8K DNA Marker

Fig7. Right arm cloning vector digestion identification

1：Trans8K DNA Marker；2：左臂表達載體酶切鑒定

2.3 細胞轉染與篩選

解凍并擴大培養sUMSCs，鋪滿6孔板， sUMSCs呈長梭形并渦旋樣生長（圖12-A）。使用1.0、1.5、2.0和2.5 μg·mL-1濃度梯度的嘌呤霉素加壓篩選最適濃度，24h后，除1.0 μg·mL-1組外的其余3組均出現大量死亡現象（圖12-B），1.0 μg·mL-1濃度組每天死亡數量較少，在篩選14d后，仍有20%的細胞存活；2.0和2.5 μg·mL-1濃度組在第6天和第4天絕大多數死亡，對細胞傷害較大（圖13）；1.5 μg·mL-1組在第12天細胞死光，既有篩選效果又作用溫和，后續試驗選其濃度進行（圖12-C）。使用脂質體Lipofectamine2000共轉染sROSA26-sgRNA1和sROSA26-HA到sUMSCs中，處理24 h后可表達綠色熒光。48 h后，對轉染組和對照組同時進行1.5 μg·mL-1濃度嘌呤霉素加壓篩選至對照組細胞全部死亡，更換無嘌呤霉素的新鮮培養基，可觀察到轉染組剩余細胞出現大量綠色熒光，成功獲得陽性克隆（圖14、15）。

1：D2000Plus DNA Marker；2：sROSA26-HA酶切鑒定

圖10 donor載體構建流程圖

圖11 DC-DON-SH02 ROSA26供體載體圖譜

2.4 陽性細胞克隆的同源重組鑒定

以提取陽性克隆細胞的全基因組為模板，針對插入外源片段后的綿羊ROSA26位點序列，分別設計上游引物SRL-F、SRL-R和下游引物SRR-F、SRR-R，PCR檢測陽性細胞的同源重組情況，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在約1 400 bp和1 000 bp處檢測到特異性條帶，且野生型則沒有條帶（圖16、17），與理論大小相符，表明利用CRISPR/Cas9技術對sUMSCs在ROSA26位點實現外源基因的定點導入。

A：sUMSCs（50×）；B：1.5μg·mL-1嘌呤霉素篩選48h后sUMSCs（50×）；C：嘌呤霉素篩選結束時sUMSCs（50×）

（在匯合度為70%-80%的sUMSCs中加入抗性，記錄細胞幾乎全部死亡的時間和濃度作為后續抗性篩選依據）

A: sUMSCs（50×）; B: After 1.5μg·mL-1puromycin screening for 48h sUMSCs（50×）; C: At the end of puromycin screening sUMSCs（50×）

(Add puromycin to sUMSCs when the confluence was 70%-80%, and record the time and concentration of almost all cell death as the foundation for subsequent resistance screening. )

圖12 篩選最佳嘌呤霉素濃度

Fig. 12 Select the best puromycin concentration

圖13 篩選最佳嘌呤霉素濃度統計圖

A：嘌呤霉素篩選16d后sUMSC-1（明視野50×）；B：嘌呤霉素篩選16d后sUMSC（暗視野50×）

（在sUMSCs細胞系中轉入帶有GFP的sROSA26-HA載體，轉染24h后加壓篩選16天后獲得的細胞多數表達綠色熒光。之后，換為普通培養基）

A: After puromycin screening for 16d sUMSC-1（Bright field 50×）; B: After puromycin screening for 16d sUMSC（Dark field 50×）

(Transfect the sROSA26-HA vector with GFP into the sUMSCs cell line, add puromycin after transfecion 24h, most cells express green fluorescence after 16 days of screening.After that, change to normal medium.)

圖14 陽性細胞克隆篩選

Fig. 14 Cloning and screening of positive cells

A：嘌呤霉素篩選16d后sUMSCs（明視野50×）；B：嘌呤霉素篩選16d后sUMSCs（暗視野50×）。

（將篩選后的陽性克隆擴大培養以獲得足夠的細胞數進行后續實驗）

A: After puromycin screening for 16d sUMSCs（Bright field 50×）; B: After puromycin screening for 16d sUMSCs（Dark field 50×）

(Subculture the screened positive clones to obtain sufficient cell numbers for subsequent experimental studies)

圖15 陽性細胞擴大培養

Fig. 15 Positive cells were further cultured

1：D2000 DNA Marker；2：同源重組上游PCR產物；3：野生型PCR產物

1：D2000 DNA Marker；2：同源重組下游PCR產物；3：野生型PCR產物

3 討論

3.1 MSCs的臨床應用

MSCs是來源于中胚層的成體干細胞, 形態類似于成纖維細胞，具有成骨、成脂及成軟骨等細胞類型的分化潛能，能自我更新和高度增殖[21]。已有研究證明，MSC的營養支持作用與免疫調節功能在組織損傷修復與疾病治療中起到重要作用，移植到體內的MSC受到不同趨化因子和生長因子的影響向特定或病損的組織或器官定向遷移，可分化成特定細胞替代病損的組織器官修復損傷[10]；同時MSCs已經被證明可以調節內源組織和免疫細胞。在同種異體移植時缺乏誘導T細胞活化的CD80等共刺激因子，因此不易發生排斥反應，既能通過增強內源修復進程解決損傷又具有較低的免疫原性，在骨與軟骨等損傷修復中具有良好的治療作用[22]。但MSC移植至宿主體內時存在時間非常短暫，難于檢測到其作用軌跡和渠道。建立利用CRISPR/Cas9系統介導敲入報告基因的綿羊示蹤臍帶間充質干細胞系，通過檢測GFP靶向定位MSCs，此舉對探索MSCs臨床治療過程與機制具有重要意義。

3.2 sgRNA的設計與篩選

根據王楚端等[9]發表的綿羊ROSA26的基因序列，針對綿羊ROSA26位點選取3條評分較高的sgRNA并合成引物。由于基因組可能出現與sgRNA識別位點相似的序列錯誤引導Cas9蛋白切割DNA出現脫靶效應[23]，以及生理狀態下染色質精密的螺旋結構和多種狀態共存的復雜情況，因此理論設計的sgRNA仍需要在細胞內進行驗證以確定其編輯效率[24-26]。利用KOD-Plus-Mutagenesis Kit點突變法構建sgRNA/Cas9真核表達載體px330-sgRNA-1/2/3。將經過Ⅰ酶切（圖1）和測序鑒定正確后的表達質粒利用Lipofectamine2000轉染至sUMSCs，T7E1酶切鑒定顯示只有sgRNA1構建的載體PCR產物有3條特異性條帶（圖3），表明px330-sgRNA-1具有打靶活性，經計算編輯效率約為20%，可以用于后續試驗。

3.3 ROSA26 safe harbor的選擇

選擇適合用于外源基因良性插入并穩定表達的基因組位點很重要，ROSA26 safe harbor概念來源于在ROSAβgeo26品系的小鼠被隨機插入單個基因，結果在所有組織中均檢測到高表達的β半乳糖苷酶且純合子幼崽能正常發育并繁殖。試驗發現插入位點位于6號染色體，該位點表達一個編碼轉錄本和兩個非編碼的轉錄本，只有非編碼轉錄本的序列受到外源插入的干擾。因此“ROSA26”位點能保證轉入基因的正常穩定表達并對細胞及小鼠的健康無副作用[27]。而后，賴良學等在豬基因組中也找到了一個特殊基因位點ROSA26，成功地構建了世界上第一個由TALEN介導的ROSA26定點敲入Cre重組酶報告基因的大動物模型[28]。在此基礎上，在ROSA26位點還引入一對異源loxp位點，利用Cre/loxP重組酶系統，可以將任意靶基因敲入到ROSA26位點，實現目的基因在大動物所有組織中的無差異表達，從而解決了一直困擾轉基因豬研究領域效率低下、表型不確定、攜帶抗性基因的問題[29]。

ROSA26基因可以在幾乎所有的生物體中編碼一種非必需的核RNA，因而成為了外源基因插入的一個熱點，因此本試驗根據綿羊Rosa26基因序列設計合成sgRNA，構建含同源序列和目的序列的載體，利用CRISPR-Cas9特異靶向ROSA26 位點生成 DNA 雙鏈斷裂，觸發細胞的 DNA 修復機制，誘導基因組與其供體克隆之間發生同源重組（HR），將靶基因整合到基因組上的 ROSA26 safe harbor 位點[30-31]，實現在sUMSCs中穩定高效表達綠色熒光。

3.4 同源重組方式敲入標記基因GFP

為了探討MSCs在患者體內的作用分化途徑，明確其黏附定植的靶組織，必須構建標記特性和生物學特性穩定的標記細胞系，以示蹤細胞在體內的治療過程，而利用基因工程技術構建標記MSCs的關鍵是選擇合適的標記物和表達載體。由于GFP具有對細胞無毒害、抗光漂白能力強、不需要任何反應底物和輔助因子、熒光強度高效、穩定持久等特點[32]。因此，本試驗利用GFP 基因標記間充質干細胞，以實現在患者體內實時跟蹤細胞治療的動態過程。研究證實，sgRNA/Cas9 在目的位點產生雙鏈斷裂后，可通過同源重組方式進行修復[26]，將外源導入的DNA作為同源重組模板，最終將外源 DNA插入到基因組中。共轉染供體同源臂質粒和sgRNA/Cas9質粒，sgRNA/Cas9質粒能使基因組發生DSB, 同源臂質粒定點整合，已成功在斑馬魚中實現外源基因的整合重組[33-34]。至今尚未見到利用CRISPR/Cas9技術同源重組外源報告基因于綿羊間充質干細胞ROSA26位點建立sUMSCs細胞系的報道。

本研究旨在sUMSCs中利用CRISPR/Cas9系統在ROSA26位點敲入報告基因GFP追蹤細胞動向，本試驗的技術難點在于如何克服knoch-in的編輯效率低下和臍帶間充質干細胞轉染困難、抗性篩選后細胞增殖困難等問題，成功獲得表達綠色熒光的陽性細胞。試驗過程中首先進行預試驗明晰sUMSCs的轉染試劑種類、試劑和質粒配比、轉染時間等條件，之后構建針對sROSA26的donor載體sROSA26-HA（圖4—9）和gRNA質粒px330-sgRNA-1，兩者共轉入sUMSCs中，在載體上具有嘌呤霉素標簽，為了避免嘌呤霉素濃度過高將導致轉染的陽性細胞被殺死，濃度過低將造成正常細胞仍然可以存活，干擾結果。用不同濃度嘌呤霉素處理間充質干細胞，得到 1.5μg·mL-1的最小致死濃度，在轉染后的細胞加入嘌呤霉素篩選，以未轉染組細胞全部死亡作為終止嘌呤霉素篩選時間點，獲得表達綠色熒光的陽性細胞（圖14、15），并利用PCR檢測其在ROSA26位點發生了GFP同源重組（圖16、17），建立了利用CRISPR/ Cas9介導的綿羊示蹤臍帶MSC系，并為綿羊MSC功能研究和臨床應用奠定基礎。盡管我們多次嘗試采用有限稀釋法嘗試獲取表達GFP的單細胞克隆，但均未成功。其原因可能在于sUMSCs轉染比較困難，試驗過程中轉染試劑和嘌呤霉素可能對細胞產生了一定損傷，挑的單個細胞傳代幾次就會發生增殖停滯或細胞凋亡，因而難以形成細胞集落。不過，分別以位于基因組和載體上的引物，提取獲得的陽性細胞基因組進行PCR鑒定，電泳結果顯示可擴增到特異條帶，表明載體已經整合到基因組中，而且在顯微鏡下可以觀察到陽性細胞絕大部分可以表達綠色熒光。因此我們判斷發生整合的細胞占數量優勢，可以用于肌肉損傷等動物模型，注射制備的陽性sUMSCs到損傷部位，追蹤sUMSCs的去向和對在組織修復中的貢獻度。

4 結論

利用突變法根據sgRNA序列打靶位點與PX330載體引入部位序列結合成功構建重組表達載體。轉染檢測其sgRNA/Cas9酶切效率約為20%。再構建sROSA26的同源打靶載體，利用脂質體共轉雙質粒在sUMSCs的ROSA26位點敲入報告基因GFP, 抗性篩選陽性克隆, PCR驗證同源重組情況，成功建立CRISPR/Cas9介導sUMSCs定點敲入外源基因GFP的綿羊示蹤臍帶間充質干細胞系。本研究結果為間充質干細胞在活體動物模型中的分化去向研究和轉基因綿羊的制備提供了科學依據。

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CRISPR/Cas9 Mediated Exogenous Gene Knock-in at ROSA26 Locus in Sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

LI SongMei, QIU YuGe, CHEN ShengNan, WANG XiaoMeng, WANG ChunSheng

College of Life Science，Northeast Forestry University, Harbin 150040

【】The use of CRISPR/Cas9 system to establish a sheep tracing umbilical cord mesenchymal stem cell line lays the foundation for the clinical therapy and mechanism of MSCs. 【】Three single guide RNAs (sgRNA)were designed and synthesized for the ROSA26 locus of sheep by using the online tool ZiFiT Targeter Version 4.2, PCR was performed using the point mutation method with the px330 plasmid as a template. The PCR product was circularized after the plasmid DNA was removed by Dpn I, the sgRNA / Cas9 vector targeting sROSA26 was constructed after enzyme digestion and sequencing identification. The constructed plasmid contained Cas9 and sgRNA expression cassettes, which were driven by the U6 promoter. Because of the off-target effect of CRISPR/Cas9 system, the vector was transfected into sUMSCs, after extraction of its genome for PCR, T7E1 enzyme digestion. Then analyzing the gray levels of the bands to detect the vector editing activity. The sgRNA / Cas9 vector can cuts the double-stranded DNA at the target site. In order to knock in the reporter gene, the Donor vector needs to repair the sequence on the donor DNA by homologous recombination at the DNA break to insert target sequence. Based on the sgRNA sequence, the left and right homology arm amplification primers were designed and synthesized at the upstream and downstream of the sROSA26 locus. Using sheep's whole genome as a template for PCR amplification to obtain left and right homology arms. After recovery and purification, recombinant with pMD19-Simple to obtain left and right homologous recombinant plasmids. The left and right homology arm plasmids were ligated with the Donor expression vector DC-DON-SH02 ROSA26 to obtain the left arm recombinant targeting vector. The homologous recombination vector carrying green fluorescent protein (GFP) and puromycin resistance gene was constructed. The survival time of cells with different concentrations of puromycin was observed in well-growing sUMSCs to determine the optimal concentration and time of resistance screening. In sUMSCs, sgRNA / Cas9 vector and Donor vector were co-transfected by liposome method. Puromycin resistance screening was performed 48 hours after transfection. After the screening, cells need to be replaced with normal media and continue to expand. Observing the expression of GFP and extracting the positive cell genome , designing two pairs of upstream and downstream primers for ROSA26 site for PCR to detect its editing status. 【】(1) Three sgRNA primers were designed for the sheep ROSA26 locus. The expression vector px330-sgRNA1/2/3 were successfully constructed by point mutation method and the vectors were transfected into sheep umbilical cord mesenchymal stem cells. T7E1 enzyme assay results indicated that the editing efficiency of px330-sgRNA1 was the highest, about 20%. (2) Based on sgRNA1, the left and right homology arms of the targeting vector were obtained by PCR, and the recombinant vector(sROSA26-HA) of sheep ROSA26 locus was successfully obtained by a series of molecular biological methods; (3) px330-sgRNA1 and sROSA26-HA were co-transfected into sheep umbilical cord mesenchymal stem cells using Lipofectamine2000, and positive colonies could express green fluorescent protein were obtained after 1.5 μg·mL-1puromycin selection for 15 days. PCR detection of one clone indicated that the targeting vector had been integrated into the genome. 【】The exogenous GFP gene could successfully integrated in specific locus of sheep umbilical cord mesenchymal stem cells using the CRISPR/Cas9 system, and these cells can be used to trace the position and differentiated cell type of MSCs. This research laid a foundation for further clinical transformation of mesenchymal stem cells.

sheep; CRISPR/Cas9; homologous recombination; sheep umbilical cord mesenchymal stem cells; GFP; ROSA26

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.015

2020-02-23；

2020-05-13

中央高校基本科研業務費專項資金資助（2572019BD02）、國家自然科學基金（31000990）

李松美，E-mail：songmei.Li@outlook.com。通信作者王春生，E-mail：wangchunsheng79@163.com

（責任編輯 林鑒非）