GA3介導miR171s及其靶基因VvSCLs調控葡萄種子發(fā)育的作用分析

王文然，解振強，諸葛雅賢，白云赫，管樂，吳偉民，張培安，鄭婷，房經貴，王晨

GA3介導miR171s及其靶基因調控葡萄種子發(fā)育的作用分析

王文然1，解振強2，諸葛雅賢1，白云赫1，管樂1，吳偉民3，張培安1，鄭婷1，房經貴1，王晨1

1南京農業(yè)大學園藝學院，南京 210095；2江蘇農林職業(yè)技術學院，江蘇鎮(zhèn)江 212499；3江蘇省農業(yè)科學院園藝研究所，南京 210014

【】鑒定vvi-miR171s成員及其靶基因，明確vvi-miR171s成員及其靶基因在葡萄種子發(fā)育中的重要作用及其響應赤霉素（Gibberellin，GA）調控種子發(fā)育的表達模式。以‘魏可’葡萄（‘Wink’）果實為試材，利用miR-RACE技術鑒定vvi-miR171a/b/e/f/g/h的成熟體序列；通過PsRNATarget軟件預測vvi-miR171s的靶基因，利用生物信息學軟件對其進行染色體定位、系統(tǒng)進化樹、基因結構、保守結構域及motif分析；通過啟動子作用元件分析預測vvi-miR171s及其靶基因的潛在功能；采用RLM-RACE和PPM-RACE驗證vvi-miR171s對靶基因的裂解作用；利用qRT-PCR鑒定其應答外源GA3在葡萄種子區(qū)中的表達模式。從‘魏可’葡萄果實中鑒定并克隆了6條葡萄vvi-miR171s成熟體序列，并用RLM-RACE和PPM-RACE鑒定到3條靶基因。靶基因的生物信息學分析顯示，2與蘋果、桃子和櫻桃同源基因遺傳距離較近，而則與擬南芥、蘋果、桃子和櫻桃中的同源基因遺傳距離相同，且的基因結構也與進化樹中親緣關系較近的基因相似；SCLs蛋白均具有GRAS結構域，鑒定到5個與GRAS結構域對應的保守motif，且它們含有的motif元件類型及排列順序均相似，表明SCL家族結構較為保守。vvi-miR171s及靶基因的啟動子均具有大量的GA、水楊酸（Salicylic acid，SA）和種子發(fā)育相關作用元件，表明它們可能參與響應GA、SA和種子發(fā)育過程；qRT-PCR表達分析顯示，GA3強烈抑制了種子區(qū)vvi-miR171a的表達，但同時顯著上調種子區(qū)的和表達；vvi-miR171a和在對照組和GA3處理后的種子/種子區(qū)均呈強烈的負相關，表明GA3可能在葡萄種子/種子區(qū)顯著增強vvi-miR171a對的負調控作用，從而介導葡萄種子發(fā)育。在‘魏可’葡萄中鑒定到vvi-miR171a/b/e/f/g/h 6個成員；均可裂解3個靶基因；vvi-miR171a-可能作為主要的調控途徑響應赤霉素并參與調控葡萄種子發(fā)育。

葡萄；vvi-miR171s；；種子發(fā)育；赤霉素

0 引言

【研究意義】葡萄（L.）是世界四大水果之一，其在鮮食、加工方面均具有極重要的經濟價值。無核是鮮食和制干葡萄重要的優(yōu)良性狀，無核因其食用方便，風味口感俱佳，倍受消費者青睞，目前已成為重要的育種目標，也是能夠顯著提高葡萄商品價值的首要性狀。葡萄種子由種皮、胚乳和胚構成，胚是種子的重要組成結構。細胞學水平的研究發(fā)現，胚敗育是導致葡萄無核化的重要原因之一[1]，胚的各部分都是由胚性細胞組成，因此胚性細胞能否正常發(fā)育是影響胚發(fā)育及無核的重要因素。【前人研究進展】目前在蘿卜[2]、百合（DC. Fisch)[3]、龍眼（）[4]、落葉松（）[5]及柑橘（）[1]中均證實miR171介導SCL6轉錄因子調控植物胚性細胞發(fā)育；同時發(fā)現杏（L.）PsmiR171-是調控杏核發(fā)育的重要miRNA[6]。這些研究均表明，miR171介導SCL轉錄因子調控胚性細胞發(fā)育，而miR171家族是功能高度保守的家族[6]，因此可推斷vvi-miR171s有可能調控影響葡萄胚性細胞發(fā)育，進而影響種子發(fā)育。2002年在擬南芥中分離得到AtmiR171，并確定、和為其靶基因[3]。SCL6是GRAS家族SCL亞家族的成員，是植物中特有的轉錄因子，其功能具有多樣性，可參與調控體細胞胚發(fā)生[7]、根組織發(fā)育[8]、重金屬脅迫[9]、光周期的調節(jié)[10]、節(jié)間形成[11]、葉綠素合成[12]、葉片形成[13]、干旱脅迫[14]及花芽分化[15]等多種生長發(fā)育進程。目前，miRBase數據庫中已收錄了38種植物的miR171家族（http://www.mirbase.org/），但不同物種間家族成員數量不同，大豆的miR171家族成員數量多達21個[16]，而在擬南芥[15]中僅發(fā)現3個，在釀酒葡萄‘黑比諾’中鑒定出8個成員（http:// www.mirbase.org/），說明miR171家族成員既具有保守性，也具有一定的特異性。據報道，GA可調控miR171-進而影響植物生命活動，擬南芥miR171-調節(jié)光照條件下葉綠素合成和葉片生長受GA - DELLA信號途徑調控；而龍眼早期體胚發(fā)生是基于DlmiR171b對GA3的響應，從而介導表達進而調控細胞形態(tài)建成[4]。雖然目前在龍眼[4]和百合[3]等物種的研究中，均已證明某個miR171家族成員可靶向SCL轉錄因子調控胚性細胞發(fā)育。【本研究切入點】尚未闡明miR171家族不同成員是共同還是獨立介導靶基因參與胚性細胞發(fā)育調控，更不清楚miR171家族能否應答赤霉素介導靶基因參與葡萄種子發(fā)育的調控。【擬解決的關鍵問題】擬通過研究vvi-miR171s應答GA3介導靶基因的作用機制，明確它們在赤霉素誘導葡萄無核過程中的作用，從表觀遺傳學角度闡釋赤霉素介導葡萄無核的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

以優(yōu)質的5年生二倍體葡萄‘魏可’為試驗材料，于2017年5月2日（花前10 d）用50 mg·L-1GA3浸蘸花序30 s，以清水處理為對照，在花后5 d（5 DAF）、10 d（10 DAF）、20 d（20 DAF）、30 d（20 DAF）和45 d（20 DAF）分別采集果實，并將種子（對照組）/種子區(qū)（GA3處理后的無核果實中與對照組種子相對應的組織部位）分離后液氮速凍，存于-80℃。

1.2 vvi-miR171s成熟體序列克隆及前體鑒定

在miRBase數據庫（http://www.mirbase.org/）搜索并下載葡萄miR171家族（vvi-miR171s）的成熟體序列。根據miRBase中下載的vvi-miR171s成熟體序列，設計特異引物，利用miR-RACE技術[17]在‘魏可’葡萄果實組織中克隆及測序鑒定其精確序列。

1.3 vvi-miR171s靶基因預測

運用PSRNA Target（http://plantgrn.noble.org/v1_ psRNATarget/），對已鑒定的vvi-miR171s成熟體序列進行靶基因預測。預測時選擇User-submitted small RNAs/preloaded transcripts一欄，并將最大期望（maximum expectation）設置為3.0，其他參數為默認設置。

1.4 vvi-miR171s及其靶基因的生物信息學分析

分別使用MEGA5.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）、Gene Structure Display Server（GSDS）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）、SMART網站（http://smart.embl-heidelberg.de/）及MEME網站（http://meme.nbcr.net/meme/）進行系統(tǒng)進化樹、基因序列結構、保守結構域及模序分析。啟動子序列在CRIBI數據庫（http://genomes.cribi.unipd.it/gb2/ gbrowse/public/vitis_vinifera_v2/）和Grape Genome Browser（http://www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/ggb/vitis/ 12X/gbrowse/vitis/）中查詢，取起始密碼子（ATG）上游1 500 bp的序列或vvi-miR171s上游1 500 bp序列作為該基因的預測啟動子，并在NEW PLACE網站（https://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/? action=newplace/）進行啟動子序列的順式作用元件分析。

1.5 檢測靶裂解位點及3′末端裂解頻率

用加ploy（A）尾巴的mRNA反轉錄合成的cDNA作為PPM-RACE【(Poly(A) polymerase-mediated 3′ RACE）poly(A)聚合酶介導3′RACE RNA】反應的模板，通用引物Gene RACE 3′為：5′-ATTCTAGAG GCCGAGGCGGCCGACATG-3′。用加接頭的mRNA反轉錄成的cDNA作為RLM-RACE【（RNA ligase- mediated 5′ RACE）連接酶介導5′ RACE】反應的模板，通用引物Gene RACE 5′為：5′-GGACACTGACATG GACTGAAGGAGTA-3′。詳細步驟參考Wang等[18]的方法。

1.6 數據處理與分析

使用Excel 2017進行數據整理，SPSS 19.0進行相關性分析。

2 結果

2.1 GA3處理后不同發(fā)育時期葡萄種子的發(fā)育狀態(tài)

從圖1可以看出，GA3使果實縱向拉長。5 DAF對照組和GA3處理組的果實胚珠均正常發(fā)育，無明顯差異。10 DAF時，GA3處理的果實胚珠與5 DAF的幾乎無差別，無明顯地生長，而對照組的果實胚珠已經明顯大于處理組。20 DAF、30 DAF和45 DAF均觀察到對照組的果實胚珠正常發(fā)育，在45 DAF已形成堅硬的種子；而GA3處理組在45 DAF果實中種子區(qū)僅存一條細線。因此，GA3在誘導葡萄無核過程中強烈地抑制了葡萄種子的發(fā)育。

2.2 vvi-miR171s成熟體序列克隆及其序列分析

2.2.1 序列克隆及其序列比對 不同于miRBase數據庫中鑒定出10個miR171家族成員，僅在‘魏可’葡萄中鑒定出vvi-miR171a/b/e/f/g/h 6個成員（圖2-a），且與miRBase數據庫中‘黑比諾’品種的同源序列完全一致（圖2-b），表明其序列在葡萄屬植物中具有高度的保守性。

2.2.2 vvi-miR171s成熟體序列進化樹分析 為了解miR171s在植物中的進化特性，對比了包括葡萄在內的5個物種39條miR171s的成熟體序列，包括葡萄6條、擬南芥3條、蘋果（）14條、柑橘9條、桃（）7條。利用MEGA 5.0構建上述植物miR171s成熟體系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結果發(fā)現這5個物種的miR171s成員進化樹被分為3大主枝：其中第二主枝僅有ppe-miR171e一個成員，第三主枝為crt-miR171b-5p和mdm- miR171f-5p，其余成員均在第一主枝。而在第一主枝上的vvi-miR171g和mdm-miR171i與其他成員距離較遠，分別位于第二、三分枝，vvi-miR171a、vvi-miR171e、vvi-miR171f、vvi-miR171h和vvi-miR171b集中在第一主枝的第一分枝上，且該分枝的每一小枝均包含5個物種。因此，vvi-miR171a、vvi-miR171e、vvi-miR171f、vvi-miR171h和vvi-miR171b 5個成員親緣關系較近，與vvi-miR171g的親緣關系較遠。同時發(fā)現miR171s在進化速率上有較大差異，而在同一植物中不同成員也呈現出差異性。

圖1 GA3對果實種子發(fā)育的影響

2.3 vvi-miR171s的靶基因預測及其序列匹配程度分析

基于已鑒定的vvi-miR171a/b/c/d/e/f序列，利用PSRNA Target為其預測到3條靶基因，分別為、、（表1）。其中，vvi-miR171e與靶基因的錯配率最低為0，vvi-miR171a、vvi-miR171b和vvi-miR171h的錯配率均為0.5，vvi-miR171f的錯配率為1.0，vvi-miR171g的錯配率最高為4。這表明、和可能為vvi-miR171s的潛在靶基因，且vvi-miR171s不同成員對靶基因的作用強度可能存在差異。

圖3 miR171s成熟體的系統(tǒng)發(fā)育樹（圓點標識為vvi-miR171s）

2.4 vvi-miR171s的靶基因驗證及其靶裂解位點分析

植物中miRNAs主要通過裂解靶基因進而調控一系列生長發(fā)育進程，因此鑒定miRNAs對靶基因的裂解作用是驗證miRNAs靶基因的最有效途徑。利用5′-RLM-RACE檢測到vvi-miR171s對、和的裂解產物，同時發(fā)現有2個裂解位點，分別位于第9位和第12位，裂解頻率分別為7/20、10/20；有3個裂解位點，分別位于第9位、第12位和第13位，裂解頻率分別為13/25、11/25和1/25；有2個裂解位點，分別位于第9位和12位，裂解頻率分別為3/20和20/23。這3條靶基因的裂解位點均具有位于miRNA的5′端第9位和第10位堿基之間所匹配的靶點，這些結果不僅證實了這3條基因是miR171s的真實靶基因，而且也表明它們裂解作用位點的保守性。

圖4 vvi-miR171s對靶基因的裂解位點示意圖

2.5 vvi-miR171s靶基因的染色體分布及基因結構分析

為了進一步了解SCL家族的基因結構及功能區(qū)域，對其進行了染色體定位（圖5-a）、構建進化樹（圖5-b）、基因結構（圖5-c）、motif（圖5-d）、domain分析（圖5-e），發(fā)現6個miR171s成員及3個靶基因分別定位在9條不同的染色體上。為了研究SCL家族成員間的進化關系，利用鄰接法構建了及其他物種中同源基因蛋白序列的進化樹（圖5-b）。進化樹顯示，5個物種的15個SCLs基因共分為兩個主枝，其中所有SCL6和SCL22分布在第一分枝上，而所有SCL15聚集在第二主枝上，這說明在進化過程中SCL6和SCL22較為相似；VvSCL6/22與桃、櫻桃（）和蘋果中的同源基因親緣關系較近，而VvSCL15則與擬南芥、桃、櫻桃和蘋果中的同源基因進化距離相同，這說明SCL家族的不同成員在進化過程中具有特異性。僅中包含1個內含子區(qū)，其他成員的基因序列中只包含UTR區(qū)和外顯子區(qū)。同時發(fā)現與其親緣關系較近的、和的外顯子區(qū)域長度較為一致，明顯長于親緣關系較遠的擬南芥同源基因；而5個的外顯子區(qū)長度也基本相同。結合motif和domain分析發(fā)現，這15個SCL家族成員motif類型及排列順序較為保守，且均具有GRAS結構域，因此可推測該家族功能較為保守，并在motif分析中找到15個SCL蛋白中該結構域對應的保守基序，分別為motif 5/6/8/9/10（圖5-f）。

2.6 vvi-miR171s啟動子的順式作用元件分析

在vvi-miR171s及其靶基因的啟動子中，富含5類順式作用元件分別是激素、光信號、低溫和干旱脅迫、組織特異性和晝夜周期節(jié)律相關作用元件（圖6-a）。對比6個miR171s成員的作用元件發(fā)現，數量上，vvi-miR171h最多，而vvi-miR171g的元件數量最少；類型上，除vvi-miR171a/g含有晝夜節(jié)律元件外，其余成員的啟動子均僅含有其余4類作用元件，其中激素、逆境和組織特異性相關響應元件占總數量的比重較大，而光響應元件數量較少。與vvi-miR171s類似，靶基因中僅啟動子中發(fā)現1個晝夜節(jié)律相關元件，光響應元件數量最少，其他3種類型的元件數量較多。同時發(fā)現miR171s及靶基因啟動子均含有大量與胚乳和花粉發(fā)育有關的順式作用元件，這些調控元件說明vvi-miR171s及其靶基因不僅對光、低溫和干旱脅迫等外界環(huán)境信號做出響應，而且還能應答激素，可能參與葡萄無核果實的生長發(fā)育。

為進一步認識vvi-miR171s及其靶基因在激素信號途徑中的作用，對激素相關順式作用元件進行分類（圖6-b）。所有啟動子均含有激素相關響應元件，主要包括GA、SA、生長素（Auxin，IAA）、脫落酸（Abscisic acid，ABA）、細胞分裂素（Cytokinin，CTK）及乙烯（Ethylene，ET）等激素響應元件，表明它們可應答多種激素信號進而參與調控葡萄生長發(fā)育。其中，GA、SA和IAA相關元件在9個基因啟動子中均存在，而ABA響應元件在vvi-miR171a/g和中未發(fā)現，CTK相關順式作用元件僅在中發(fā)現，ET元件則在vvi-miR171e/h和中未發(fā)現。另外，在眾多激素元件中，GA和SA作用元件的數量明顯多于其他激素，而GA和SA是葡萄種子發(fā)育的關鍵激素，特別是與無核葡萄果實的發(fā)育密切相關[19-20]，表明miR171s及靶基因可能通過響應激素信號參與無核葡萄的發(fā)育過程。

2.7 vvi-miR171s及靶基因在葡萄種子發(fā)育不同時期的時空表達特征

2.7.1 在葡萄種子不同發(fā)育時期時空表達分析 如圖7所示，根據表達量水平可將vvi-miR171s分為3類，vvi-miR171a為最高，其次是vvi-miR171b/e/f，vvi-miR171g幾乎不表達，未檢測到vvi-miR171g；靶基因中僅檢測到/，未檢測到。/呈現完全相反的表達模式，在20 DAF檢測到最高水平，在30 DAF最低；而則在20 DAF未檢測到表達量，而在30 DAF最高。vvi-miR171s中除vvi-miR171b在20 DAF檢測到最高水平外，其他成員均在45 DAF檢測到最高水平。vvi-miR171s與/相關性分析發(fā)現（圖7），vvi-miR171a/f-（=-0.82/-0.98）、vvi-miR171b-（=-1.00）具有顯著負相關性，而vvi-miR171b-（=1.00）和vvi-miR171a/f-則為顯著正相關（=0.83/0.98），這一結果也為vvi-miR171s成員以不同的途徑和作用方式調節(jié)靶基因進而調控種子發(fā)育提供了證據；vvi-miR171a/f-、vvi-miR171b-在葡萄種子發(fā)育過程中均存在負調控關系，結合表達水平認為vvi-miR171a-為調控種子發(fā)育過程的主要成員。

a：vvi-miR171s啟動子中各類響應元件的數量；b：響應不同激素的作用元件數量

2.7.2 vvi-miR171s及靶基因應答GA3的模式分析 為進一步認識葡萄vvi-miR171s及其靶基因在種子區(qū)對外源GA3的時空響應模式，利用對照和GA3處理的種子區(qū)樣品cDNA為模板，進行定量分析。圖7-a為對照與GA3處理后的葡萄種子區(qū)vvi-miR171s及/的表達水平。GA3處理后種子區(qū)vvi-miR171s響應GA3的模式可分為2類，vvi- miR171a/e/f/h的表達量顯著下調，而vvi-miR171b/g則在GA3處理后上調；與CK相比，的表達量均顯著升高。同時相關性分析表明（圖7-b、c），GA3處理后，vvi-miR171a-（=-1.00）、vvi- miR171b/g/h-（=-0.88/-0.97/-0.79）呈顯著負相關；而GA3處理后種子區(qū)vvi-miR171f-由顯著負相關性（=-0.98）變?yōu)轱@著正相關（=0.91），同時vvi-miR171/f/h-（=0.91、0.80）為顯著正相關，這表明vvi-miR171s在種子發(fā)育過程中以不同的模式響應赤霉素信號。

由于miRNA家族中各個成員的作用可能存在冗余現象，因此利用vvi-miR171s的累計表達量與靶基因的表達量進行分析（圖8）。值得注意的是，GA3強烈抑制了種子區(qū)vvi-miR171s的表達（圖8），其中vvi-miR171a（圖7-b）的下調程度遠超過其他成員，表明在葡萄種子區(qū)，vvi-miR171a可能是該家族中應答GA3的主要成員。同時發(fā)現，GA3顯著上調種子區(qū)的和2，且GA3處理后，vvi-miR171a-呈負調控關系，因而推測vvi-miR171a負調控是vvi-miR171s響應赤霉素信號調控種子發(fā)育的主要途徑。

3 討論

據報道，不同物種中miR171s的功能不完全一致。在擬南芥[15]、大麥[13]和煙草[21]中發(fā)現miR171c調控腋生分生組織形成；落葉松LxmiR171在胚性細胞中過表達后，可促進誘導胚性愈傷組織[22]，同時LxmiR171a/b和LxmiR171c還可以調控原胚和體胚誘導階段[23]；百合Lpu-miR171a[24]在胚性愈傷組織階段表達量最高，而Lpu-miR171b、Lda-miR171a和Lda-miR171c的表達量均在魚雷形胚階段出現最高值；甜橙miR171在胚性愈傷組織中有高表達，主要在柑橘細胞胚性誘導和保持過程中發(fā)揮作用[1]；vvi-miR171s對葡萄花芽分化具有一定作用[25]；利用STTM和CRISPR/Cas9技術，發(fā)現水稻miR171a參與葉綠素、脯氨酸的合成過程，并對植物生長勢和抗旱能力有調節(jié)作用[26]；SlmiR171b不僅在番茄花粉萌發(fā)過程中起負調控作用，也參與了番茄的呼吸躍變過程，并負調控果實中葡萄糖、果糖和番茄紅素等營養(yǎng)物質的積累[27]；而Lin等[6]發(fā)現杏（L.）PsmiR171-與種子發(fā)育相關，且不同成員在種子不同發(fā)育時期發(fā)揮重要作用。

本研究的靶裂解位點結果表明，、和均為vvi-miR171s的靶基因，但對不同時期種子區(qū)cDNA進行定量檢測，未檢測到的表達量，這可能是由于表達量很弱或具有組織、發(fā)育時期特異性。與葡萄中的其他microRNAs類似[28-29]，miR171s也具有時空特異的表達模式。本研究發(fā)現，在葡萄硬核期種子區(qū)vvi-miR171a相比其他成員表達量較高，vvi-miR171a可能作為主要成員影響種子發(fā)育，說明葡萄miR171s的功能可能與擬南芥、落葉松和柑橘中的存在差異性，葡萄中極可能存在特異性的調控途徑。同時，類似于擬南芥AtmiR171c[22,30]及百合Lpu-miRl71a/b[24]，葡萄vvi-miR171a與靶基因之間也存在明顯的負調控的關系。本研究利用3′-PPM-RACE和5′-RLM-RACE技術驗證了vvi-miR171a/b/e/f/g/h對的裂解作用，這與miR171s在擬南芥[31]、落葉松[5]和龍眼[4]中通過對和的轉錄產物切割而進行調控的結論一致，驗證了這3條靶基因的真實性；同時確定了的裂解位點均位于miR171a/b/e/f/g/h的5′端第9位和第10位堿基之間所匹配的靶點上，與擬南芥[31]中miR171靶基因的裂解位點一致，說明miR171s對靶基因裂解作用位點的保守性。

圖8 種子/種子區(qū)中vvi-miR171s累計表達量與靶基因的時空表達分析、作用模式及應答GA3的模式分析

研究發(fā)現miR171及靶基因可參與GA信號轉導，GA3可上調龍眼miR171b和的表達進而影響胚性細胞的發(fā)育；Ma等[12]發(fā)現miR171-SCL受擬南芥GA-DELLA信號途徑調節(jié)，在葉綠素合成中起關鍵調控作用，這些研究均證明miR171-SCL可能通過對GA信號的響應調控植物生長進程。與龍眼[4]不同，GA3顯著下調了葡萄種子區(qū)vvi-miR171a的表達，而上調了和；同時，vvi-miR171a與存在負調控關系，結合GA3高效誘導葡萄無核的效果，及vvi-miR171a可能是miR171s在硬核期調控種子發(fā)育的主要成員，推測赤霉素信號通過下調vvi-miR171a影響靶基因的表達，最終影響葡萄種子的發(fā)育。本研究初步鑒定了vvi-miR171s-可能是vvi-miR171s調控靶基因，響應赤霉素信號參與葡萄種子發(fā)育的主要途徑，這將為進一步研究vvi-miR171s及靶基因響應赤霉素信號調控葡萄種子發(fā)育的分子機制研究奠定重要基礎。

4 結論

在‘魏可’葡萄中鑒定到vvi-miR171a/b/e/f/g/h 6個成員，并利用3′-PPM-RACE和5′-RLM-RACE技術驗證了它們對3個靶基因的裂解作用及裂解位點。通過對vvi-miR171s和在葡萄種子中的時空表達模式分析，發(fā)現vvi-miR171a-可能作為主要的調控途徑響應赤霉素信號并參與調控葡萄種子發(fā)育。

[1] WU X M, LIU M Y, GE X X, XU Q, GUO W W. Stage and tissue-specific modulation of ten conserved miRNAs and their targets during somatic embryogenesis of Valencia sweet orange. Planta, 2011, 233: 495-505.

[2] ZHAI L L, XU L, WANG Y, HUANG D Q, YU R G, LIMERA C, GONG Y Q, LIU L W. Genome-Wide Identification of Embryogenesis- Associated microRNAs in Radish (L.) by High- Throughput Sequencing. Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 32(4): 900-915.

[3] 賈娜娜. 百合體胚發(fā)生過程中miR171及其靶基因的鑒定與表達分析[D].沈陽: 沈陽農業(yè)大學, 2016.

JIA N N. Identification and expression analysis of miR171 and target geneduring somatic embryogenesis in[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[4] 蘇立遙, 張帥, 陳旭,徐小萍, 賴鐘雄, 林玉玲. miR171家族成員分子特性及miR171b調控靶標在龍眼體胚發(fā)生早期的表達分析. 果樹學報, 2018, 35(11): 1324-1334.

SU L Y, ZHANG S, CHEN X, XU X P, LAI Z X, LIN Y L. Molecular characteristics of miR171 family members and analysis of the expression pattern of mi R171b regulatory targets during early somatic embryogenesis in longan. Journal of Fruit Science, 2018, 35(11): 1324-1334. (in Chinese)

[5] LI W F, ZHANG S G, HAN S Y, WU T, ZHANG J H, QI L W. The post-transcriptional regulation ofby miR171 during maintenance of embryogenic potential in(Lamb.) Carr. Tree Genetics & Genomes, 2014, 10: 223-229.

[6] NIU J, WANG J, AN J Y, LIU L L, LIN Z X, WANG R, WANG L B, SHI L L, LIN S Z. Integrated mRNA and miRNA transcriptome reveal a cross-talk between developing response and hormone signaling for the seed kernels of. Scientific Reports, 2016, 6: 35675.

[7] LI H Y, ZHANG J, YANG Y, JIA N N, WANG C X, SUN, H M. miR171 and its target genecontribute to embryogenic callus induction and torpedo-shaped embryo formation during somatic embryogenesis in two lily species. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2017, 130: 591-600.

[8] DI Laurenzio L, WYSOCKA-DILLER J, MALAMY J E, PYSH L, HELARIUTTA Y, FRESHOUR G, HAHN M G, FELDMANN K A, BENFEY P N. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential or generating the radial organization of theroot. Cell, 1996, 86(3): 423-431.

[9] ZHOU Z S, HUANG S Q, YANG Z M. Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2008, 374(3): 538-542.

[10] SIRE C, MORENO A B, GARCIASHAPA M, LOPEZ-MOYA J J, SAN Segundo B. Diurnal oscillation in the accumulation ofmicroRNAs, miR167, miR168, miR171 and miR398. Febs Letters, 2009, 583(6): 1039-1044.

[11] STERNES P R, MOYLE R L. Deep sequencing reveals divergent expression patterns within the small RNA transcriptomes of cultured and vegetative tissues of sugarcane. Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 33(4): 931-951.

[12] MA Z X, HU X P, CAI W J, HUANG W H, ZHOU X, LUO Q, YANG H Q, WANG J W, HUANG J R.miR171-targeted Scarecrow-like proteins bind to GT-elements and mediate gibberellin-regulated chlorophyll biosynthesis under light conditions. PLOS Genetics, 2014, 10(8): e1004519.

[13] CURABA J, TALBOT M, LI Z Y, HELLIWELL C. Over-expression of microRNA171 affects phase transitions and floral meristem determinancy in barley. BMC Plant Biology, 2013, 13: 6.

[14] HWANG E W, SHIN S J, YU B K, BYUN M O, KWON H B. miR171 family members are involved in drought response in., 2011, 54(1): 43-48.

[15] WANG L, MAI Y X, ZHANG Y C, LUO Q, YANG H Q. MicroRNA171c-Targeted,, andgenes regulate shoot branching in. Molecular plant, 2010, 3(5): 794-806.

[16] 王艷芳, 趙彥宏, 張萍, 周瑞蓮. 大豆miR-171基因家族的進化與功能分析. 植物遺傳資源學報. 2015, 16(5): 1089-1092.

WANG Y F, ZHAO Y H, ZHANG P, ZHOU R L. Molecular evolution and targets prediction of gma-miR171 gene family in Soybean. Journal of Plant Genetic Resources, 2015, 16(5): 1089-1092. (in Chinese)

[17] WANG C, WANG X C, KIBET N K, SONG C N, ZHANG C Q, LI X Y, HAN J, FANG J G. Deep sequencing of grape flower and berry Short RNA libraries for the discovery of new microRNAs and verification of the precise sequence of grape microRNAs preserved in miRBase. Physiologia Plantarum, 2011, 143(1): 64-81.

[18] Wang C, Han J, Korir N K, WANG X C, LIU H, LI X Y, LENG X P, FANG J G. Characterization of target mRNAs for grapevine microRNAs with an integrated strategy of modified RLM-RACE, newly developed PPM-RACE and qPCRs. Journal of Plant Physiology, 2013, 170(10): 943-957.

[19] CHENG C X, JIAO C, SINGER S D, GAO M, XU X Z, ZHOU Y M, LI Z, FEI Z J, WANG Y J, WANG X P. Gibberellin-induced changes in the transcriptome of grapevine (×) cv. Kyoho flowers. BMC Genomics, 2015, 16: 128.

[20] CHENG C X, XU X Z, SINGER S D, Li J, ZHANG H J, GAO M, WANG L, SONG J Y, WANG X P. Effect of GA3treatment on seed development and seed-related gene expression in grape. PLoS ONE, 2013, 8(11): e80044.

[21] 張力, 沙愛華. 煙草microRNA171c的功能分析. 植物科學學報, 2016, 34(5): 775-780.

ZHANG L, SHA A H. Functional analysis of microRNA171c in tobacco. Plant Science Journal, 2016, 34(5): 775-780. (in Chinese)

[22] ZHANG S G, ZHOU J, HAN S Y, YANG W H, LI W F, WEI H L, LI X M, QI L W. Four abiotic stress-induced miRNA families differentially regulated in the embryogenic and non-embryogenic callus tissues of. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010, 398: 355-360.

[23] ZHANG J H, ZHANG S G, HAN S Y, WU T, LI X M, LI F W, QI L W. Genome-wide identification of microRNAs in larch and stage-specific modulation of 11 conserved microRNAs and their targets during somatic embryogenesis. Planta, 2012, 236: 647-657.

[24] 王京. 百合體胚發(fā)生過程中pre-miR171及eTM171表達分析與載體構建[D]. 沈陽: 沈陽農業(yè)大學, 2018.

WANG J. Expression analysis of pre-miR171 and eTM171 during somatic embyogenesis and vector construction in[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2018.

[25] 孫欣. 葡萄microRNA164和microRNA171調控其靶基因的功能分析[D]. 南京: 南京農業(yè)大學, 2015.

Sun X. Identification and interaction of grapevine micoRNA164 and micoRNA171 and their targets [D]. 2015, Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[26] 黃格格. 利用CRISPR/Cas9技術研究miR171a及靶基因功能[D]. 海口: 海南大學, 2019.

Huang G G. Study on the functions of miR171a and its target genes by using CRISPR/Cas9 [D]. Haikou: Hainan University, 2019. (in Chinese)

[27] 潘燕婷. miR171b 在番茄生長發(fā)育中的功能研究[D]. 浙江: 浙江大學, 2020.

PAN Y T. The role of miR171b in the regulation of growth and development in tomato [D]. Zhejiang: Zhejiang University, 2020. (in Chinese)

[28] 王文然, 王晨, 解振強, 賈海鋒, 湯崴, 崔夢杰, 房經貴. VvmiR397a及其靶基因在葡萄果實發(fā)育中的作用分析. 園藝學報, 2018, 45(8): 18-32.

WANG W R, WANG C, XIE Z Q, JIA H F, TANG W, CUI M J, FANG J G. Function analysis of VvmiR397a and its target genesin grape berry development. Acta Horticulturae Sinica, 2018, 45(8): 1441-1455. (in Chinese)

[29] 白云赫, 王文然, 董天宇, 管樂, 宿子文, 賈海鋒, 房經貴, 王晨. vvi-miR160s介導應答赤霉素調控葡萄種子的發(fā)育. 中國農業(yè)科學, 2020, 53(9): 1890-1903.

BAI Y H, WANG W R, DONG T Y, GUAN L, SU Z W, JIA H F, FANG J G, WANG C. vvi-miR160s in mediatingresponse to gibberellin regulation of grape seed development. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(9): 1890-1903. (in Chinese)

[30] 曾友競, 林玉玲, 崔彤彤, 陳曉慧, 徐小萍, 張梓浩, 程春振, 陳裕坤, 賴鐘雄. 龍眼miR171家族進化特性及其表達分析. 西北植物學報, 2017, 37(2): 258-265.

ZENG Y J, LIN Y L, CUI T T, CHEN X H, XU X P, ZHANG Z H, CHENG C Z, CHEN Y K, LAI Z X. Evolutionary charaterization and expression of miR171 family inLour. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2017, 37(2): 258-265. (in Chinese)

[31] LLAVE C, XIE Z X, KASSCHAAU K D, CARRINGTON J C. Cleavage of scarecrow-like mRNA targets directed by a class ofmiRNA. Science, 2002, 297: 2053-2056.

Function Analysis of GA3Mediate miR171s and Its Target Genesin Grape Seed Development

WANG WenRan1, XIE ZhenQiang2, ZHUGE YaXian1, BAI YunHe1, GUAN Le1, WU WeiMin3, ZHANG PeiAn1, ZHENG Ting1, FANG JingGui1, WANG Chen1

1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry, Zhenjiang 212499, Jiangsu;3Insititute of Horticulture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014

【】The main objective of the present research was to identify the vvi-miR171s and their target genesfrom grapevine genome, and to confirm the role of vvi-miR171s andVvSCL6/15/22 in grape seed development process and their expression pattern in response to exogenous GA. 【】The mature sequences of vvi-miR171a/b/e/f/g/h were validated by miR-RACE technique from grape (L.) cv ‘Wink’. The potential target genes of vvi-miR171s were predicted by PsRNATarget software, and the chromosome localization, phylogenetic, gene structure, conserved domain and motifs analysis were performed by bioinformatics tools. The potential functions of vvi-miR171s and their target genes were predicted by promoters-elements analysis. RLM-RACE and PPM-RACE verified the cleavage roles of three target genes by vvi-miR171a/b/e/f/g/h, and the qRT-PCR method was used to detect their temporal expression patterns in grape seed and seedless grape induced by exogenous GA3.】Six vvi-miR171s mature sequences in grape were determined and cloned, which were consistent of the sequences of miRBase. Based on this result, the target genes of them, including,andwere prophesied.The target genes bioinformatics analysis showed evolutionary genetic distance betweengenes and homologous genes in apple (), peach (), and cherry ()is relatively closed, whilehad the same genetic distance from the homologous genes in, apple, peach and cherry. Meanwhile, the gene structure ofwas similar to their close genes in phylogenetic tree. All SCL protein sequences had GRAS domain, both element types, arrangement order of motifs. And 5 same motifs for GRAS domain were identified, indicating that the SCL protein structure was relatively conservative, with the conserved functionality. Subsequently, an array of gibberellin and Salicylic acid responsive-acting elements were identified in vvi-miR171s and target genespromoter sequences, indicating their possible involvement in the regulation of GA-responsive and SA-responsive grape growth and development. Moreover, the qRT-PCR analysis revealed that the expression of vvi-miR171a was significantly repressed by GA3in seed, while its target geneshowed reciprocal expression pattern, particularly. There was a strong negative correlation between vvi-miR171a -VvSCL15 in the grape seed of CK and seed region of GAtreatment. Taken together, vvi-miR171a might the major member of vvi-miR171s in response to GA, additionally, it might involve in the grape berry seed development through negative regulating of VvSCL15gene developmental in response to GA3. 【】vvi-miR171a/b/e/f/g/h were identified from grapevine ‘Wink’, and all of members could cleave three target genes. The vvi-miR171a-might be the major member in response to gibberellin and involve in regulating grape seed development.

grape; vvi-miR171s;; seed development; gibberellin

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.011

2020-04-27；

2020-05-27

國家自然科學基金（31972373）、江蘇省自然科學基金（BK20181318）、句容市農業(yè)課題（JRNW[2018]03號）

王文然，E-mail：2017104029@njau.edu.cn。通信作者王晨，E-mail：wangchen@njau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）