馬鈴薯健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結構及其對碳源利用特征

趙衛松，郭慶港，蘇振賀，王培培，董麗紅，胡卿，鹿秀云，張曉云，李社增，馬平

馬鈴薯健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結構及其對碳源利用特征

趙衛松，郭慶港，蘇振賀，王培培，董麗紅，胡卿，鹿秀云，張曉云，李社增，馬平

河北省農林科學院植物保護研究所/河北省農業有害生物綜合防治工程技術研究中心/農業農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000

【】通過研究馬鈴薯健康植株與黃萎病株的根際土壤真菌群落結構與功能多樣性的差異，明確土壤真菌群落結構與黃萎病發生之間的關系，為最終從微生物生態學的角度解釋馬鈴薯黃萎病的發生原因及其生態防控提供理論依據。以河北省壩上地區馬鈴薯健株與黃萎病株的根際土壤為研究對象，分別利用實時熒光定量PCR（real-time PCR）和高通量測序（Illumina Miseq）技術檢測根際土壤中大麗輪枝菌（）ITS基因拷貝數量并分析真菌群落結構變化，結合冗余分析（RDA）明確真菌群落結構與土壤養分的相關性。同時利用Biolog-ECO平板法比較健株與黃萎病株根際土壤微生物對碳源的利用能力。馬鈴薯黃萎病的發生與土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數量存在相關性，在病株根際土壤中病原菌數量高，而在健株根際土壤中未檢測到病原菌。高通量測序分析表明，病株根際土壤真菌多樣性指數低于健康植株，但多樣性差異不顯著。在群落組成的門水平上，與健株根際土壤相比，病株根際土壤中的子囊菌門（Ascomycota）和絲孢菌門（Mortierellomycota）相對豐度上升幅度分別為20.68%和16.16%，而擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度下降51.43%。在屬水平上，病株根際土壤中輪枝菌屬（）、青霉屬（）、維希尼克氏酵母屬（）、紅酵母屬（）和芽枝霉屬（）的相對豐度呈上升趨勢，增加倍數分別為71.96、3.62、6.11、15.38和6.24倍，而小不整球殼屬（）、、葡萄穗霉屬（）、赤霉屬（）、曲霉屬（）菌群的相對豐度下降幅度分別為45.10%、61.41%、96.87%、45.85%和44.39%。真菌群落組成與土壤養分的冗余分析（RDA）表明，健株根際土壤優勢群落的相對豐度（如小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬）與硝態氮、有機質和pH呈正相關，而黃萎病株根際土壤優勢群落的相對豐度（如輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬）與無機磷和速效磷呈正相關。不同根際土壤的AWCD值表明，病株根際土壤微生物對碳源的利用能力高于健株。進一步分析發現，與健株相比，病株土壤微生物對羧酸類碳源的利用能力顯著提高，而對氨基酸類、胺類、碳水化合物類、聚合物類和雙親化合物類碳源利用能力差異不顯著。病株的根際土壤真菌多樣性降低和群落結構改變是馬鈴薯黃萎病發生的重要特征，其中輪枝菌屬菌群的相對豐度顯著提高是最主要特征，并且真菌群落結構受土壤養分影響。同時，病株根際土壤微生物對羧酸類碳源利用能力顯著提高。

馬鈴薯黃萎病；大麗輪枝菌；根際土壤；真菌群落結構；高通量測序；土壤養分；Biolog技術

0 引言

【研究意義】馬鈴薯（）是我國第4大糧食作物[1]。馬鈴薯產業是農民增收的主要來源之一，對保障我國糧食安全具有重要意義。目前，我國是馬鈴薯種植面積和產量最大的國家，分別占世界馬鈴薯總面積和總產量的25%和22%[2]。近年來，由于馬鈴薯連作導致土傳病害有逐年加重的趨勢，給馬鈴薯產業帶來了較大的經濟損失。馬鈴薯黃萎病又稱早死病或早熟病，是典型的土傳兼種傳維管束病害，輕者減產20%—30%，重者損失達50%以上，嚴重影響馬鈴薯的產量和品質[3-4]。在我國新疆、河北、甘肅、陜西、內蒙古、寧夏、黑龍江、吉林、貴州等地已有關于馬鈴薯黃萎病發生的報道[5-9]。因此，針對馬鈴薯黃萎病的防治工作至關重要。研究馬鈴薯健康植株和黃萎病株根際土壤的真菌群落結構，有助于揭示黃萎病發生與真菌群落兩者之間的互作關系，可為進一步篩選對馬鈴薯黃萎病有拮抗作用的有益微生物和病害防治提供新思路。【前人研究進展】目前，有關馬鈴薯黃萎病的研究主要集中在抗性品種篩選、病原菌種類鑒定、致病力測定、病害防治技術等方面[5-10]。微生物群落結構與植物健康狀況之間的關系已成為研究的熱點，而關于土壤微生物群落結構與馬鈴薯黃萎病發生之間的關系尚不清晰。研究表明，土傳病害的發生與土壤微生物區系的改變存在一定的相關性[11-13]。Gorissen等[11]研究發現，馬鈴薯青枯病（病原菌biovar 2）的病田土壤細菌多樣性低于健康土壤，且細菌群落結構發生了變化；祈建軍等[14]研究發現，地黃根腐病（病原菌）發生與其根際土壤微生物呼吸、代謝熵密切相關。近年來，隨著測序技術的快速發展，通過高通量測序技術能夠從土壤微生物群落水平分析土傳病害發生的可能主導因子，可以更好地理解馬鈴薯健株和病株土樣之間真菌的組成及差異，從而為馬鈴薯黃萎病防治提供更好的思路和解決方法，而另一方面Biolog技術則是從代謝功能角度研究土壤微生物群落功能多樣性的變化。【本研究切入點】盡管已有學者研究了馬鈴薯連作對土壤微生物群落結構的影響[15]，但黃萎病菌（大麗輪枝菌）侵染馬鈴薯對根際土壤真菌群落結構產生的影響及其對碳源利用特征的變化情況尚缺乏系統的認識。【擬解決的關鍵問題】以馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術研究馬鈴薯植株根際土壤真菌群落結構的變化，分析真菌群落結構與土壤養分之間的關系，結合Biolog方法對不同根際土壤微生物對碳源的利用能力進行比較，以期揭示黃萎病發生與土壤真菌群落結構的互作關系，為生防菌篩選和利用微生態調控手段防控馬鈴薯黃萎病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區域概況

壩上地區包括河北省圍場滿族蒙古族自治縣部分地區，地處東經116°32′—118°14′，北緯41°35′—42°40′，是全國重點馬鈴薯種薯繁育和商品薯基地縣，全縣馬鈴薯年平均種植面積約2.93萬公頃。年平均氣溫在-0.5—6.0℃，平均降水量為300—560 mm，時空分布上差異較大，70%的降水集中在6—8月，無霜期區域分布差異較大。馬鈴薯黃萎病主要由土壤和種薯傳播，寄主范圍廣，流行性強，近年來有發生的報道[10]。

1.2 材料

供試馬鈴薯品種荷蘭15（感黃萎病品種），由圍場滿族蒙古族自治縣志偉馬鈴薯種植專業合作社提供，用于田間試驗。

1.3 根際土壤樣品的采集

試驗于2019年在河北省圍場滿族蒙古族自治縣牌樓鄉紅砬子村（東經117°15′，北緯41°56′）進行。馬鈴薯根際土壤取自連續種植馬鈴薯5年的地塊，土壤類型為沙壤土。具體采集方法如下：在馬鈴薯黃萎病發生時期（8月上旬），參考趙衛松等[8]馬鈴薯黃萎病的病害分級標準，選擇馬鈴薯健康植株和黃萎病植株（發病等級為3級以上）作為研究對象，用取樣鏟分別將馬鈴薯健株和病株整個根系完整挖出，輕敲根系，與根系結合較松的土壤棄去，將與根系緊密結合的土壤用毛刷清理。健株與病株分別取4個點，每取樣點即為1份，取樣點間隔30 m，每取樣點選擇5株馬鈴薯采集根際土壤混合而成。土壤樣品裝入低溫保溫箱中帶回實驗室，過2 mm篩后一部分保存于4℃冰箱用于Biolog測定，一部分保存于-80℃冰箱，用于真菌群落結構高通量測序分析。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 土壤真菌群落結構的高通量測序 采用FastDNATMSPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）試劑盒提取土壤基因組DNA，利用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）檢測DNA的純度和濃度，DNA于-20℃保存備用。以樣品DNA為模板，采用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對其進行目標片段的ITS可變區擴增[16]。PCR擴增體系為20 μL：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，引物（5 μmol·L-1）各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板（20 ng·μL-1）1 μL，最后用滅菌的ddH2O將反應體系補至20 μL。PCR反應程序參數：95℃預變性3 min，27個循環（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對其目標片段進行切膠回收。純化后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Illumina Miseq PE 300平臺進行高通量測序。

1.4.2 土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數量的測定 按照1.3方法采集馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤，參考趙衛松等[17]方法分別測定土壤中大麗輪枝菌ITS基因的拷貝數量。具體方法如下：以大麗輪枝菌基因組DNA為模板，利用大麗輪枝菌特異性引物DB19（CGGTGACATAATACTGAGAG）/DB20（GACGATGCGGATTGAACGAA）擴增ITS部分序列。將PCR產物與pMD19-T Vector連接、轉化于DH5感受態細胞中，提取重組質粒，并10倍梯度稀釋后，將其作為模板進行實時熒光定量PCR擴增。以質粒拷貝數的對數值為橫坐標，以循環閾值Ct值為縱坐標建立標準曲線。以不同土壤DNA作為模板進行實時熒光定量PCR反應，得到不同樣本的循環閾值，根據建立的標準曲線計算土壤中大麗輪枝菌的拷貝數。

1.4.3 土壤養分的測定 參考Wang等[18]方法分別對馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤的酸堿度（pH）、硝態氮（NO3--N）、速效磷（AP）、無機磷（IP）和有機質（OM）含量進行測定。

1.4.4 健株與黃萎病株根際土壤的碳源利用特征比較 采用Biolog-ECO技術分析微生物群落對31種碳源（分為6大類，氨基酸類、碳水化合物類、胺類、羧酸類、聚合物類以及雙親化合物類）的代謝特征，即功能多樣性。ECO板接種液的制備：將土壤樣品在25℃條件下活化24 h，取3 g根際土加入含有27 mL滅菌的NaCl溶液（0.85 mol·L-1）的錐形瓶中180 r/min振蕩45 min。取3 mL上清液加入到27 mL NaCl溶液，混勻后再取3 mL上清液加入到27 mL NaCl溶液，最終稀釋比例為1﹕1 000，并將制備的接種液轉移至儲液槽中。利用8孔道排槍向ECO板的各孔中加入150 μL的稀釋液，每個土樣的稀釋液按方法要求設置3組平行。將接種好的微孔板放入25℃的恒溫培養箱中，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 d使用ELxS08-Biolog微孔板讀數儀（Bio-Tek Instruments Inc，USA）進行測定，測定波長分別為590 nm（顏色+濁度）和750 nm（濁度）。

1.5 數據分析

微生物代謝活性用590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值表示，其中數值＜0.06時按0處理。孔的平均顏色變化率（average well color development，AWCD）計算方法如下[19]：AWCD = Σ（C-R）/n。式中，C為每個碳源孔的兩波段光密度差值；R為對照孔的光密度值；n為培養基碳源種類數（n=31）。微生物對碳源的相對利用率，以健株和黃萎病株根際土壤處理的6類碳源AWCD值中最大的值為100%，其余以不同處理的各類碳源AWCD值與最大值的比值即為相對利用率。

試驗數據采用Microsoft Excel 2010進行整理，Origin 8.6進行作圖，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析、獨立樣本T檢驗統計分析。采用Canoco 4.5軟件對健株和黃萎病株根際土壤真菌群落組成進行主成分分析（PCA）及其與土壤養分的冗余分析（RDA），并利用CanoDraw軟件進行作圖。

2 結果

2.1 健株和黃萎病株根際土壤養分變化

馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤養分之間存在不同程度的差異。與健株相比，除了土壤pH不存在顯著差異外，黃萎病株根際土壤中的速效磷和無機磷含量顯著升高，而硝態氮和有機質含量顯著降低（表1）。

表1 健株與黃萎病株根際土壤養分變化

數據后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different lowercases after the data indicate significant difference (＜0.05). The same as below

2.2 健株和黃萎病株根際土壤中大麗輪枝菌的數量測定

分別對采集的健株和黃萎病株根際土壤中大麗輪枝菌的數量進行測定，將每克土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數量轉換為對數，結果表明，黃萎病株根際土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數量為8.86，而健株根際土壤中未檢測到目標病原菌。

2.3 土壤真菌多樣性分析

獲得的健株根際土壤樣本有效序列數目為67 602條，黃萎病株根際土壤樣本有效序列條目為62 390條。與健株根際土壤相比，黃萎病株根際土壤真菌多樣性指數呈現出下降趨勢，但差異不顯著（表2）。

2.4 根際土壤真菌群落的特異性分析

通過對健株與黃萎病株根際土壤樣品中真菌群落Venn圖的比較分析，可以清晰地展現出根際土壤真菌群落OTU數目組成、特異性、重疊或相似性。在OTU分類水平上的特異性分析發現，共有真菌OTU數量為269個，其中健株根際土壤特有109個OTU，黃萎病株根際土壤特有81個OTU（圖1-A）。在屬分類水平上的特異性分析發現，共有真菌的屬為126個，健株根際土壤特有35個屬，黃萎病株根際土壤特有18個屬（圖1-B）。

A：OTU水平at OTU level；B：屬水平at genus level

2.5 根際土壤真菌群落結構主成分分析

由圖2可知，健株與黃萎病株根際土壤真菌在OTU水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的85.24%和9.49%，2個主成分方差累積貢獻率達到94.73%，說明其能夠表征真菌群落組成的特征。同時，相同處理的土壤樣品在主坐標中位于不同的象限，表明相同處理植株間存在區別，進一步分析發現健株與黃萎病株根際土壤的真菌群落結構差異顯著（=1.0000，=0.034）。

2.6 根際土壤真菌群落結構變化

2.6.1 門水平根際土壤真菌群落結構變化 將豐度＜1%的歸為其他，門水平下健株與黃萎病株根際土壤真菌群落組成的研究結果表明（圖3），獲得的優勢菌群包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和絲孢菌門（Mortierellomycota），其平均相對豐度分別介于68.43%—82.58%、13.75%—28.30%和2.83%—3.28%。與健株根際土壤相比，黃萎病株的子囊菌門和絲孢菌門的相對豐度上升，上升幅度分別為20.68%和16.16%；而擔子菌門的相對豐度下降，下降幅度為51.43%。

圖2 健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結構的主成分分析

2.6.2 屬水平根際土壤真菌群落結構變化 將處理中至少1組相對豐度＞1%進行統計，豐度＜1%、未能鑒定或未培養的菌群歸為其他，屬水平下健株與黃萎病株根際土壤真菌群落組成的研究結果表明（圖4），獲得的優勢菌群為小不整球殼屬（）、、輪枝菌屬（）、鐮孢菌屬（）、鏈格孢屬（）、刺盤孢屬（）、被孢霉屬（）、葡萄穗霉屬（）、腐質霉屬（）、赤霉屬（）、曲霉屬（）、青霉屬（）、維希尼克氏酵母屬（）、紅酵母屬（）和芽枝霉屬（），其平均相對豐度分別介于15.40%—28.05%、10.59%—27.46%、0.47%—37.42%、10.49%—10.75%、2.37%—6.10%、2.24%—3.89%、2.83%—3.28%、0.14%—4.45%、1.14%—1.61%、0.86%—1.59%、0.71%—1.27%、0.30%—1.38%、0.19%—1.37%、0.07%—1.12%和0.14%—1.00%。與健株根際土壤相比，黃萎病株根際土壤中輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬的相對豐度呈上升趨勢，增加倍數分別為71.96、1.57、0.74、0.16、0.42、3.62、6.11、15.38和6.24倍；而小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬菌群的相對豐度呈下降趨勢，下降幅度分別為45.10%、61.41%、96.87%、45.85%和44.39%。

表2 健株和黃萎病株根際土壤真菌Alpha多樣性

圖3 門水平真菌群落組成相對豐度變化

采用獨立樣本T檢驗進一步對健株和黃萎病株根際土壤真菌屬水平物種差異進行分析（圖5），結果表明健株和黃萎病株根際土壤真菌平均相對豐度較高的前15個菌群中，存在顯著差異的菌群包括小不整球殼屬（=0.0308）、（=0.0034）、輪枝菌屬（=0.0002）、鏈格孢屬（=0.0016）、葡萄穗霉屬（=0.0053）、曲霉屬（=0.0237）、紅酵母屬（=0.0205）、芽枝霉屬（=0.0426）；不存在顯著差異的菌群包括赤霉屬（=0.0530）、鐮孢菌屬（=0.9101）、刺盤孢屬（=0.3880）、被孢霉屬（=0.4321）、腐質霉屬（=0.4792）、青霉屬（=0.0876）、維希尼克氏酵母屬（=0.0850）。

圖4 屬水平真菌群落組成相對豐度變化

X軸代表不同的分組，不同顏色的箱子表示不同的分組，Y軸代表某一物種在不同分組中的平均相對豐度

2.7 真菌屬水平群落結構與土壤養分含量的冗余分析

屬水平土壤優勢真菌群落結構與土壤養分含量的相關性分析表明（圖 6），2個坐標軸總共解釋93.5%的真菌群落結構與土壤養分含量的關系，能夠較好地反映土壤養分含量對土壤真菌群落結構的影響。進一步分析表明，健株與黃萎病株根際土壤優勢群落的相對豐度對土壤養分的響應不同。其中，健株根際土壤優勢群落的相對豐度（如小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬）與硝態氮、有機質和pH呈正相關，而黃萎病株根際土壤優勢群落的相對豐度（如輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬）與無機磷和速效磷呈正相關。

綠色圓形代表健株根際土壤（1—4），紅色圓形代表黃萎病株根際土壤（5—8） The green circle represents rhizosphere soil of healthy plants, the red circle represents rhizosphere soil of diseased plants

2.8 健株與黃萎病株根際土壤微生物AWCD變化

AWCD 值提供了不同根際土壤微生物對相同碳源利用的差異性，反映了微生物對碳源的利用能力，從功能代謝方面表示微生物群落結構功能多樣性。由圖7可知，隨著培養時間的延長，健株和黃萎病株根際土壤微生物活性不斷升高，自1 d起AWCD值迅速升高，7 d后趨于穩定狀態。進一步對健株和黃萎病株根際土壤微生物的AWCD值分析發現，黃萎病株根際土壤微生物的AWCD值在不同時間均高于健株根際土壤。

2.9 健株和黃萎病株根際土壤微生物對碳源利用特征

由圖8可知，健株和黃萎病株根際土壤微生物對氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類物質具有較高的利用率，達到70%以上，其次為聚合物類和胺類，對雙親類化合物的利用率最低。健株根際土壤微生物對氨基酸類、羧酸類、胺類、碳水化合物類、聚合物類和雙親化合物類的相對利用率分別為72.94%、79.63%、30.32%、82.44%、37.66%和12.02%；而黃萎病株根際土壤微生物對上述6類碳源的相對利用率分別為74.09%、100%、31.28%、83.24%、40.99%和12.35%。差異顯著性分析表明，黃萎病株根際土壤微生物對羧酸類相對利用率顯著高于健株（＜0.05），而對其他5類碳源的相對利用率差異不顯著。

圖7 健株與黃萎病株根際土壤微生物AWCD變化

3 討論

3.1 作物病害發生與根際土壤微生物群落結構的關系

土壤微生物群落不僅是植株根際的重要組成部分，而且在植物生長發育及病害防治方面具有重要作用[20]。土壤微生物多樣性是維持土壤生態功能的基礎，其對維持土壤健康和抑制植物病害至關重要。吳照祥等[21]認為土壤健康狀況不能簡單地以真菌群落生物多樣性來表示，其他指標（如真菌的組成及豐度）也能夠用于指示土壤健康狀況。許多研究表明土壤微生物群落多樣性和組成與土傳病害的發生存在一定的聯系，豐富的微生物群落會提高土壤對土傳病害的抑制能力，但二者關系比較復雜[22-23]。

目前，關于土傳病害導致的土壤微生物群落多樣性發生改變存在不同的觀點。一部分學者認為，健株根際土壤中真菌多樣性顯著高于感病土壤，群落組成發生改變[24-25]。劉海洋等[26]對棉花黃萎病不同發病程度根際土壤真菌群落的研究表明，重病棉田土壤中真菌多樣性低于輕病或健康棉田；李忠奎等[27]研究表明，煙草黑脛病和根結線蟲病的土壤真菌多樣性低于健康煙田，感病煙田土壤病原菌數量增加是導致多樣性下降的主要因素之一，并且在根際土壤微生物群落結構方面存在明顯差異；Shang等[28]研究發現，健康蘭州百合根際土壤真菌多樣性高于根腐病發病土壤，發病根際土壤中除了鐮孢菌屬豐度較高外，輪枝菌屬、絲核菌屬、青霉屬和的相對豐度也較高。

圖8 健株和黃萎病株根際土壤微生物對6類碳源的相對利用率

另一部分學者認為，健株和感病植株的根際土壤真菌多樣性差異不顯著，但真菌群落組成存在差異[21,29-30]。宋旭紅等[29]研究表明，黃連根腐病株及健株根際土壤真菌多樣性差異不顯著，在病株土壤中子囊菌門、擔子菌門和壺菌門的相對豐度顯著高于健株土壤，而接合菌門、球囊菌門和Neocallimastigomycota的相對豐度則顯著低于健株土壤；在屬水平上，病株土壤中鐮孢菌屬的相對豐度顯著高于健株土壤。吳照祥等[21]研究認為，健株和感病植株的根際土壤真菌多樣性差異不顯著，健株根際土壤中火絲菌屬（）和被孢霉屬的相對豐度顯著高于感病植株根際土壤，尖鐮孢和周刺座霉屬的相對豐度則顯著低于感病植株土壤。本研究結果表明，馬鈴薯健株根際和黃萎病發病植株根際土壤真菌多樣性差異不顯著，健株根際土壤的小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬和曲霉屬的相對豐度顯著高于感病植株根際土壤，而感病植株根際土壤中輪枝菌屬、鏈格孢屬、紅酵母屬和芽枝霉屬的相對豐度顯著高于健株土壤。LUAN等[30]報道棉花枯萎病和黃萎病株根際土壤中鐮孢菌屬和輪枝菌屬數量較多，而在健康棉花根際土中木霉屬（）等有益菌的數量顯著高于發病棉花。本研究通過實時熒光定量PCR和高通量測序發現，馬鈴薯黃萎病株根際土壤輪枝菌屬含量（或相對豐度）顯著高于健株根際土壤，相對豐度是健株根際土壤的71.96倍，表明馬鈴薯黃萎病的發生與輪枝菌屬含量的大幅度增加密切相關，獲得了與LUAN等[30]相似的研究觀點。此外，鏈格孢屬菌群是引起馬鈴薯早疫病的病原菌，在病株根際土壤中相對豐度顯著高于健株土壤；刺盤孢屬和鐮孢菌屬分別是引起馬鈴薯炭疽病和枯萎病的病原菌，其相對豐度在馬鈴薯健株與病株根際土壤中差異不顯著；而在健株根際土壤中曲霉屬的相對豐度顯著高于病株根際土壤。由此推測，在拮抗微生物資源篩選方面，可以通過有針對性地篩選曲霉屬菌群作為候選拮抗微生物菌群來抑制黃萎病。

此外，少數學者研究發現，病株根際土壤真菌多樣性高于健株土壤，且真菌群落組成發生改變。臍橙黃龍病株根際土壤真菌多樣性高于健康土壤，且菌群中子囊菌門、擔子菌門和球囊菌門與病害發生存在顯著的相關性[31]。綜合分析認為，作物病害發生與根際土壤微生物群落結構關系非常復雜，但均顯著改變土壤微生物群落組成，尤其是病株根際土壤中增加了病原菌的數量或相對豐度。

3.2 健株、病株根際土壤養分含量與植物病害發生的關系

陳杰等[15]研究表明，馬鈴薯連作種植的病株土壤中速效磷和速效鉀含量均低于健株土壤，銨態氮含量在健株土壤低于病株土壤，推測可以通過增加磷、鉀肥的施用量及同時適當減少氮肥用量來提高馬鈴薯植株的抗病性，減少土傳病害的發生；李忠奎等[27]研究表明，健康煙株根際土壤的有機質、全氮、堿解氮、全磷、有效磷、全鉀、速效鉀含量顯著高于易感病煙田；白霜等[32]研究發現，新疆棉花黃萎病株土壤有機質、可溶性總鹽含量均高于健株，棉花病株與健株土壤pH無明顯差異，棉花黃萎病病害發生與棉花土壤有機質、可溶性總鹽含量密切相關；段春梅等[33]對黃瓜枯萎病株與健株土壤養分進行比較，結果表明病株土壤中的速效磷、速效鉀含量分別較健株降低了16.3%和16.8%，病株和健株土壤中速效氮、有機質、水溶性鹽分含量及pH無差異，說明土壤速效磷、速效鉀含量與黃瓜枯萎病發生有一定關系。本研究結果表明，馬鈴薯黃萎病的發生與根際土壤速效磷和無機磷含量存在正相關性，病株與健株根際土壤pH無明顯差異。進一步推測，健株與病株根際土壤養分與植物病害發生的關系可能因病害和作物種類的不同而存在區別。綜合分析健株和病株根際土壤真菌群落組成與土壤養分之間的關系，可為合理施肥改善土壤微生物的群落結構，進而降低土傳病害的發生提供科學依據。

土壤有機質在維持土壤質量中起著關鍵作用[34]。Shen等[35]研究表明，土壤微生物組成與土壤有機質相關性最高，并且土壤有機質與香蕉枯萎病的發生和鐮孢菌屬的相對豐度存在顯著的負相關關系，表明土壤有機質對病害具有潛在抑制作用；Liu等[36]研究表明，土壤中鐮孢菌對馬鈴薯枯萎病及其產量造成影響，鐮孢菌屬的相對豐度與土壤有機質和總氮量呈負相關關系；Leon等[37]研究表明，土壤有機質含量與菜豆根腐病發生呈負相關關系；Davis等[38]研究發現，土壤中有機質含量高能夠使馬鈴薯黃萎病發病率下降。本研究結果表明，馬鈴薯健株根際土壤真菌群落結構和豐度與有機質、硝態氮含量存在正相關性，而與速效磷和無機磷含量存在負相關性（圖6）。因此，通過人工施肥等措施改變根際土壤硝態氮和有機質含量、降低速效磷和無機磷的含量，從而調整病原菌和有益真菌的比例，對今后預防或降低馬鈴薯黃萎病的發生具有重要意義。

3.3 健株與病株根際土壤微生物對碳源利用能力分析

Biolog微生物鑒定方法是測定土壤微生物群落功能代謝多樣性的一種有效手段，通過測定不同碳源的平均吸光值，能夠反映微生物對各類碳源的利用情況。國內外利用該方法在研究土壤微生物代謝功能多樣性方面開展了大量的工作[39-42]。張麗娟等[43]研究表明，大蒜根腐病株和健株根際土壤微生物對碳源有不同的利用強度，健康大蒜根際土壤微生物對碳水化合物和聚合物類碳源利用能力較高，病株根際土壤微生物對胺類和羧酸類碳源利用程度較高；顧美英等[44]研究核桃健株和腐爛病株根際土壤微生物對碳源的利用情況，結果表明健株土壤微生物對碳水化合物類和氨基酸類碳源有較強的利用能力，而腐爛病株根際土壤微生物利用碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源能力下降；吳照祥等[21]研究發現，三七健株和根腐病株根際土壤微生物對碳源利用能力無顯著差異。本研究結果表明，與馬鈴薯健株根際土壤相比，黃萎病株的根際土壤微生物顯著提高了對羧酸類碳源的利用能力，而對碳水化合物類、氨基酸類等碳源的利用能力差異不顯著。在10個羧酸類碳源方面，健株與病株對碳源利用能力的強弱和種類發生改變，健株根際土壤微生物利用強弱順序表現為4-羥基苯甲酸＞-羥基丁酸＞D-葡萄胺酸＞衣康酸＞D-半乳糖內酯＞D-半乳糖醛酸＞丙酮酸甲酯＞D-蘋果酸＞2-羥基苯甲酸＞-丁酮酸，而病株根際土壤微生物利用強弱順序表現為4-羥基苯甲酸＞-羥基丁酸＞D-蘋果酸＞D-半乳糖醛酸＞D-葡萄胺酸＞2-羥基苯甲酸＞D-半乳糖內酯＞衣康酸＞-丁酮酸＞丙酮酸甲酯，且病株對相同碳源的利用能力強于健株。在6個氨基酸類碳源方面，健株與病株對碳源利用的強弱順序均表現為L-天冬酰胺酸＞L-苯基丙氨酸＞L-精氨酸＞L-絲氨酸＞甘氨酰-L-谷氨酸＞L-蘇氨酸，兩者利用能力差異不顯著。在3個胺類碳源方面，健株與病株的利用強弱順序均表現為N-乙酰-D-葡萄糖胺＞苯乙基胺＞腐胺，病株利用能力高于健株，但差異不顯著。在7個碳水化合物類碳源方面，健株根際土壤微生物利用強弱順序表現為-D-乳糖＞肝糖＞D-纖維二糖＞D-甘露醇＞i-赤藻糖醇＞-甲基-D-葡萄糖苷＞D-木糖，而病株根際土壤微生物利用強弱順序為D-纖維二糖＞-D-乳糖＞肝糖＞D-甘露醇＞i-赤藻糖醇＞D-木糖＞-甲基-D-葡萄糖苷。在3個聚合物類碳源方面，健株根際土壤微生物利用強弱順序表現為吐溫40＞吐溫80＞-環式糊精，而病株根際土壤微生物利用強弱順序表現為吐溫80＞吐溫40＞-環式糊精，病株對相同碳源的利用能力強于健株。在2個雙親化合物類碳源方面，健株與病株對碳源利用的強弱順序均表現為葡萄糖-1-磷酸鹽＞D, L--磷酸甘油。

Biolog-ECO技術能快速反映微生物群落功能多樣性的變化特征。Biolog-ECO生態板中的31種碳源物質可分為氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、胺類、聚合物類以及雙親化合物類，其中碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類物質是植物根系分泌物的主要成分。因此，在借助Biolog方法研究健康與發病植株根際土壤微生物功能多樣性時，應將碳源代謝利用情況與植物根系分泌物聯系起來，以完善該技術在微生物多樣性研究中的應用。已有研究表明，病原菌侵入寄主后會改變植株生理代謝，導致根系分泌物中一些成分及含量發生變化，從而可能導致健康植株與發病植株根際微生物數量、種類以及對碳源的利用能力明顯不同[45-46]。本研究采用Biolog技術探明了健株與黃萎病株根際土壤微生物代謝活動的差異，從微生物群落功能多樣性方面探索黃萎病發生的可能原因。

此外，已有學者發現，通過研究根際土壤微生物群落，為探索土壤中存在拮抗微生物提供了新的線索[47]。本研究通過高通量測序技術分別獲得了健株與黃萎病株根際土壤特異的真菌菌群。將不能分離鑒定或平均相對豐度＜1%的歸為其他，在健株根際土壤特異的菌群包括，（2.13%）、（2.66%）、瓣菌屬（，2.66%）、（3.19%）、（4.26%）、盤菌屬（，4.26%）。在黃萎病株根際土壤特異的菌群包括，（83.83%）和（1.14%）。因此，通過高通量測序了解健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結構，從馬鈴薯健株根際土壤特異菌群中篩選馬鈴薯黃萎病新的拮抗菌，是篩選生防菌并構建具備拮抗功能的健康馬鈴薯微生物菌群的潛在資源。

4 結論

黃萎病株根際土壤真菌多樣性指數降低，且大麗輪枝菌的數量大于健株根際土壤。健株與黃萎病株根際土壤的優勢真菌群落相對豐度對土壤養分的響應不同，健株根際土壤優勢群落的相對豐度（如小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬）與硝態氮、有機質和pH呈正相關，黃萎病株根際土壤優勢群落的相對豐度（如輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬）與土壤無機磷和速效磷含量呈正相關。健株與病株根際土壤優勢群落的相對豐度與土壤養分含量表現相反的趨勢。此外，與健株相比，病株根際土壤微生物對羧酸類碳源的利用能力顯著提高，最終揭示黃萎病發生與土壤真菌群落結構的互作關系。

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Characterization of fungal community structure in the rhizosphere soil of healthy and diseased-verticillium wilt potato plants and Carbon source utilization

ZHAO WeiSong, GUO QingGang, SU ZhenHe, WANG PeiPei, DONG LiHong, HU Qing, LU XiuYun, ZHANG XiaoYun, LI SheZeng, MA Ping

Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Centre of Hebei Province/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Baoding 071000, Hebei

【】The objective of this study is to research the differences of the structure and functional diversity of fungal community in the rhizosphere soil of healthy and diseased potato plants, and to clarify the relationship between the structure of soil fungal community and the occurrence of verticillium wilt, so as to provide a theoretical basis for the final explanation of the causes of potato verticillium wilt and ecological control from the perspective of microbial ecology.【】The rhizosphere soil of healthy and diseased plants of verticillium wilt of potato was collected from Bashang area in Hebei Province. The number of ITS gene copies ofwas determined by real-time quantitative PCR, and the structure of soil fungal communities was measured by high-throughput sequencing (Illumina MiSeq). The quantity ofand the community of soil fungi were analyzed. The redundancy analysis (RDA) was used to determine the correlation between fungal community structure and soil nutrient. Meanwhile, the utilization capacity of rhizosphere soil microorganisms of healthy and diseased plants to carbon source was compared by Biolog-Eco plate method.【】The occurrence of verticillium wilt of potato was related to the ITS gene copy number ofin soil. The ITS gene copy number of pathogens was high in rhizosphere soil of diseased plants, but not detected in healthy plants. Illumina MiSeq analysis showed that the diversity index of fungi in rhizosphere soil of diseased plants was lower than that of healthy plants, but the diversity difference was not significant. Compared with the rhizosphere soil of healthy plants, at phylum level, the relative abundance of Ascomycota and Mortierellomycota was increased by 20.68% and 16.16%, respectively, while that of Basidiomycota was decreased by 51.43%. At genus level, the average relative abundance of,,,andin rhizosphere soil of diseased plants was increased by 71.96, 3.62, 6.11, 15.38 and 6.24 times, respectively, while that of,,,,was decreased by 45.10%, 61.41%, 96.87%, 45.85% and 44.39%, respectively. RDA of fungal community composition and soil nutrient showed that the relative abundance of dominant communities in rhizosphere soil of healthy plants (such as,,,and) was positively correlated with nitrate nitrogen (NO3--N), organic matter (OM) and pH, while the relative abundance of dominant communities in rhizosphere soil of diseased plants (such as,,,,,,,and) was positively correlated with inorganic phosphorus (IP) and available phosphorus (AP). The AWCD values of rhizosphere soil of healthy and diseased plants indicated that the utilization ability of microorganisms to carbon source in rhizosphere soil of diseased plants was higher than that of healthy plants. Further analysis showed that, compared with the healthy plants, the utilization ability of rhizosphere soil microorganisms to carboxylic acids carbon source was significantly improved, while the utilization ability to amino acids, amines, carbohydrates, polymers and miscellaneous was not significantly different.【】The decrease of fungal diversity and the change of community structure in rhizosphere soil of healthy and diseased plants are the important characteristics of potato verticillium wilt. The significant increase of relative abundance ofis the most important characteristic, and the structure of fungal community is affected by soil nutrient. At the same time, the utilization of carboxylic acids carbon source is significantly increased by rhizosphere soil microorganisms of diseased plants.

potato verticillium wilt;; rhizosphere soil; fungal community structure; Illumina MiSeq; soil nutrient; Biolog technique

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.006

2020-04-16；

2020-05-19

國家重點研發計劃（2017YFD0200601）、國家公益性行業（農業） 科研專項（201503109）、河北省農林科學院現代農業科技創新工程（1-02-03）

趙衛松，Tel：0312-5927076；E-mail：zhaoweisong1985@163.com。通信作者馬平，Tel：0312-5915678；E-mail：pingma88@126.com

（責任編輯 岳梅）