高壓氧對糖尿病型牙周炎牙齦細胞凋亡及凋亡因子表達的調控作用研究

陳鐵樓,許 兵，郭梓琰, 張新海,馬麗婷, 王世鋒,陳 駿,劉 進 ,方以群

糖尿病型牙周炎(diabetes-associated periodontitis, DAP)患者因血糖升高和糖耐量降低引起機體抵抗力降低，易誘發(fā)牙齦炎癥、牙槽骨吸收和組織愈合減慢[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者發(fā)生牙周炎的危險性比非糖尿病患者明顯增高，牙周炎患者凋亡相關蛋白表達增高，可影響胰島細胞凋亡及其分泌功能。老年牙周炎患者牙齦組織中凋亡細胞數(shù)量增加[3]。白細胞介素1β(IL-1β)可刺激人牙周韌帶細胞中膠原酶合成，誘導基質金屬蛋白酶13表達，調控人成骨細胞擴增和凋亡[4]。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，DAP患者牙齦組織中IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量高于健康組，牙齦細胞凋亡明顯增加[5]。高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)可對人牙周炎起治療作用[6]，但HBO對DAP患者牙齦細胞凋亡和凋亡因子表達及機制罕見報道，本研究擬探討HBO對DAP患者牙齦細胞凋亡及與IL-1β、TNF-α、前列腺素E2(PGE2)、Caspase3表達的關系，為用HBO治療DAP及機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

1.2 主要試劑

TNF-α抗體(北京華夏遠洋科技有限公司)，IL-1β抗體(上海陽光生物科研網(wǎng))，PGE2 抗體(上海基免實業(yè)有限公司)，兔抗Caspase3抗體 (南京凱基生物科技有限公司)。免疫組化(IHC)SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 指標測定

1.3.1 臨床指標測定 每例患者選10顆牙(包括上頜和下頜切牙各2顆，前磨牙各1顆，磨牙各2顆)，于初診和治療1個月后，分別測定各組患者齦溝出血指數(shù)(SBI)和牙松動度，按Loe標準測定菌斑指數(shù)(PLI)、牙齦指數(shù)(GI)，用標準刻度探針測定每個牙的牙周袋深度(PD)和附著喪失(AL)，PD和AL取測定牙頰側近中、中央、遠中和舌側中央4點的平均值。

1.3.2 HE染色和TUNNEL法檢測細胞凋亡[5]在臨床指標后，每組在治療前和治療后1個月各選擇符合拔牙適應證的2例松動牙，拔除時在其舌側取牙齦組織，一部分立即放入4%甲醛中固定，待行HE、TUNNEL和IHC染色；另一部分用4%多聚甲醛固定制作透射電鏡標本。

取經(jīng)4%甲醛固定24 h牙齦組織，石蠟包埋，切5 μm切片。①HE染色觀察牙齦上皮和固有層細胞凋亡；②TUNNEL染色觀察細胞凋亡情況，細胞凋亡陽性染色為棕黃色或褐色。高倍鏡(40倍)下，用10×10網(wǎng)格分別對視野下的牙齦上皮層陽性細胞和細胞總數(shù)計數(shù)，每張切片觀察10個視野，計算基底層和棘層細胞凋亡指數(shù)(AI)=陽性細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%。

1.3.3 透射電鏡觀察細胞凋亡[5]將4%多聚甲醛固定的牙齦組織脫水和樹脂包埋，常規(guī)超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.3.4 IHC測定牙齦組織中TNF-α、IL-1β、PGE2及Caspase3表達[5]對經(jīng)包埋的牙齦組織，5 μm連續(xù)切片,脫蠟,3%過氧化氫孵育，滴加山羊血清封閉非特異性抗體，加一抗(1∶100)，4 ℃冰箱過夜。滴加生物素標記二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育各15 min。DAB顯色，蘇木素復染，固定封片。以PBS代替一抗做陰性對照,陽性細胞染為黃褐色。在顯微鏡( ×200)下用圖像分析系統(tǒng)測量陽性染色的吸光度值，每張切片選擇10個染色陽性視野測定TNF-α、IL-1β、PGE2及Caspase3含量，計算其均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用t檢驗和方差分析比較治療前與治療后1個月時每兩組間PLI、GI、SBI、PD、AL差異，及牙齦中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3表達量的差異，兩組間凋亡細胞陽性表達指數(shù)的差異采用χ2檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HBO對牙周臨床指標影響

3組在治療后1個月時SBI、GI、PD與治療前比均有顯著性差異，治療后1個月時HBO+SRP組的SBI、GI、PD、AL比HBO組和SRP組明顯降低；治療后1個月時SRP組和HBO+SRP組PLI比治療前明顯降低(表1)。

表1 3組在治療前、治療后1個月時SBI、GI、PLI、PD、AL比較Tab.1 Comparison of SBI, GI, PLI, PD, AL between the 3 groups before and 1 month after treatment

2.2 HE染色結果

HBO組在治療后1個月時牙齦上皮層基底細胞和棘細胞凋亡比治療前明顯減少，固有層巨噬細胞和淋巴細胞減少，血管明顯增多；SRP組牙齦組織細胞凋亡減少，血管數(shù)量增加不明顯；HBO+SRP組在治療后1個月時細胞凋亡數(shù)量比HBO組和SRP組減少，凋亡程度減輕，血管數(shù)量明顯增加(圖1 A～C)。

A：HBO組治療前； B：HBO組治療后1個月； C：HBO+SRP組治療后1個月; 凋亡細胞()；紅細胞(★)；血管(▲)

2.3 TUNNEL結果

HBO組和SRP組在治療后1個月時陽性細胞數(shù)量比治療前明顯減少，凋亡細胞位于基底細胞層和棘細胞層，染色為陽性；HBO+SRP組牙齦上皮層和固有層凋亡細胞數(shù)量比HBO組和SRP組明顯減少，凋亡細胞呈陽性或弱陽性(圖2)。HBO+SRP組基底細胞和棘細胞的凋亡細胞指數(shù)比HBO組和SRP組明顯減少(表2)。

A：SRP組; B：HBO組治療前; C：HBO組治療后1個月；D：HBO+SRP組治療后1個月；凋亡細胞()

表2 3組治療前、治療后1個月時牙齦上皮層和固有層凋亡細胞陽性表達指數(shù)比較Tab.2 Comparison of positive expression index of apoptosis cell in basal cell and acanthocyte between 3 groups before and 1 month after treatment %

2.4 超微結構變化

DAP患者在HBO治療前凋亡細胞核固縮，與胞質分離出現(xiàn)間隙，內質網(wǎng)疏松形成空泡，胞質濃縮，線粒體腫脹，可見胞膜內陷形成凋亡小體。HBO組和SRP組在治療后1個月時細胞凋亡數(shù)量和凋亡程度明顯減輕，HBO+SRP組細胞凋亡的核固縮程度明顯減輕，膠原纖維排列整齊，成纖維細胞內線粒體未見明顯水腫，凋亡小體少見(圖3)。

2.5 HBO對牙齦組織TNF-α、IL-1β、PGE2和Caspase3表達影響

DAP患者在HBO治療前牙齦固有層TNF-α、IL-1β、PGE2染色呈強陽性，主要陽性細胞為巨噬細胞和淋巴細胞,基底細胞呈弱陽性；牙齦上皮和固有層Caspase3呈強陽性，主要陽性細胞為上皮基底細胞和棘細胞，巨噬細胞和淋巴細胞呈弱陽性。HBO組和SRP組在治療后1個月時TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 陽性細胞數(shù)量和染色強度減輕；HBO+SRP組固有層染色陽性細胞數(shù)量和程度比HBO組和SRP組明顯減輕(圖4)。根據(jù)Lamber-Beer定律，組織中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 含量與吸光度值成正比，可用吸光度值來反映，治療后1個月時3組的牙齦組織中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3值與治療前有顯著性差異，HBO+SRP組治療后1個月時TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 值明顯小于HBO組和SRP組(表3)。

表3 3組治療前、治療后1個月時牙齦組織中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3吸光度值比較Tab.3 Comparison of absorbency of TNF-α, IL-1β, PGE2 and Caspase3 in gingival between 3 groups before and 1 month after treatment

A：HBO組治療前； B：HBO組治療后1個月； C：HBO+SRP組治療后1個月；凋亡細胞核固縮 (); 線粒體(▲); 纖維(★)

3 討 論

糖尿病與牙周炎存在雙向關系，DAP與牙齦細胞凋亡密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡表現(xiàn)為細胞核固縮及蛋白降解，牙周致病性的伴放線聚集桿菌和牙齦卟啉單胞菌可誘導牙齦上皮細胞和成纖維細胞凋亡[8]。Alikhani等[9]報道，細菌脂多糖在TNF-α作用下可增加凋亡因子Caspase8活性，促進成纖維細胞凋亡；牙齦卟啉單胞菌侵入牙齦上皮2 h，可促進Bax蛋白表達增強。糖尿病的高血糖可增加促凋亡基因Caspase 活性和mRNA水平，促進成纖維細胞和成骨細胞凋亡[10]，影響傷口愈合和組織修復。本研究發(fā)現(xiàn)，DAP患者牙齦上皮層基底細胞和棘細胞凋亡，凋亡細胞體積變小，線粒體腫脹，胞膜內陷，核染色體固縮。

牙周厭氧菌能激活人單核細胞產(chǎn)生IL-1β，刺激成纖維細胞產(chǎn)生膠原酶和PGE2，誘導骨吸收。炎癥時多型核白細胞浸潤,釋放TNF-α和IL-1β，誘發(fā)炎癥反應。糖尿病患者高血糖可誘導活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)直接損傷牙周組織或通過影響胰島b細胞,激活氧化應激敏感信號通路,包括NF-kB、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)等,導致TNF-α等炎性因子產(chǎn)生，激活膠原酶和破骨細胞引起牙周組織破壞[11]。DAP由于長期高血糖導致高級糖基化終產(chǎn)物增加，通過絲裂原活化蛋白激酶刺激細胞凋亡與細胞表面受體結合導致TNF-α、IL-1β和PGE2分泌，促進成纖維細胞凋亡，影響牙周組織修復[12]。本研究發(fā)現(xiàn)DAP患者牙齦組織中IL-1β、TNF-α和PGE2表達量升高，與患者SBI、GI、PD和AL增加和細胞凋亡程度正相關。

Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)HBO聯(lián)合促紅細胞生成素可抑制脊髓損傷大鼠神經(jīng)元凋亡，促進其損傷修復。HBO暴露可防止蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的兔膀胱細胞凋亡和收縮能力受損[14]，HBO可上調BDNF/TrkB信號通路，通過抗凋亡和抑制樹突狀/突觸變性，改善脊髓損傷所致的神經(jīng)功能障礙[15]。本研究發(fā)現(xiàn)HBO組凋亡基因Caspase3表達明顯降低，HBO+SRP組對Caspase3作用明顯強于HBO組和SRP組。SRP組患者Capsase3降低可能與牙周潔治去除細菌對牙齦細胞刺激，炎癥因子分泌減少，促凋亡因子減少，細胞凋亡被抑制有關。

在牙周炎癥狀態(tài)下，免疫細胞活動增強，炎癥因子合成和分泌增加，參與牙周組織的破壞。牙周致病菌可通過受損的牙周組織進入血循環(huán)，加重糖尿病的發(fā)展[16]。2型糖尿病患者齦溝液中的IL-1β、PGE2 水平明顯高于非糖尿病患者[17]，而IL-1β、PGE2可刺激DAP骨吸收，誘導蛋白酶產(chǎn)生，抑制膠原和非膠原合成[18]。我們以往發(fā)現(xiàn)HBO暴露可抑制牙周袋內厭氧菌繁殖對牙周炎起治療作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)HBO組和SRP組在治療后1個月時牙齦中TNF-α、IL-1β、PGE2水平明顯降低，HBO+SRP組牙齦中IL-1β、TNF-α、PGE2水平降低更明顯，且與SBI、GI、PD、AL值及細胞凋亡指標Caspase3表達降低一致，表明HBO可通過抑制牙周炎牙齦組織中IL-1β、TNF-α、PGE2產(chǎn)生，降低Caspase3表達，減少牙齦細胞凋亡，HBO聯(lián)合SRP對糖尿病型牙周炎IL-1β、TNF-α、PGE2和Caspase3 抑制作用更明顯，并可維持1個月以上。有關HBO暴露對糖尿病型牙周炎細胞凋亡的時間效應的影響另文發(fā)表。

炎細胞 ()；基底細胞(▲)