蒙藥漏蘆花HPLC指紋圖譜及4種有效成分的含量測定研究

吳東興，文 花，白玉霞，李淑艷，白金亮，玉 華，白梅榮，紅 艷，辛 穎

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

漏蘆花為特色蒙藥，蒙文名為洪格勒珠爾、洪古日朱勒等，是菊科漏蘆屬植物祁州漏蘆的干燥頭狀花序，具有解表、殺黏、清熱解毒、止刺痛等功效[1]。始載于《認(rèn)藥白晶鑒》，漏蘆花是特色蒙藥，應(yīng)用歷史悠久，除對于慢性疾病具有良好的療效以外，還具有預(yù)防疾病、綜合保健以及衰老的效果[2]。以漏蘆花為君藥的蒙藥復(fù)方制劑有琪琪格-3、漏蘆花-12、漏蘆花-11、漏蘆花-13等[3]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)漏蘆花化學(xué)成分[4-7]、提取工藝[8-11]和藥理[12，13]研究等方面的報道較多，主要成分為揮發(fā)油、黃酮、生物堿、萜類、糖類等，具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。目前對內(nèi)蒙古產(chǎn)地漏蘆花的定性定量研究較少，本課題組在前期研究[14]基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行指紋圖譜與有效成分的含量測定研究，旨在為蒙藥漏蘆花的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀(LC-20AT型、DAD檢測器，日本島津公司)；Welchrom-C18色譜柱(4.6mm×300mm，5μm， 月旭科技股份有限公司)，電子分析天平(SQP型，1/10萬，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，超聲波清洗儀(KQ5200DB型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑

甲醇(色譜級，F(xiàn)isher Scientific公司)，乙腈(色譜級，F(xiàn)isher Scientific公司)，實驗用的其它試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材樣本

11批蒙藥漏蘆花采自內(nèi)蒙古地區(qū)，樣品信息見表1，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為祁州漏蘆的干燥花。綠原酸對照品(批號：17306-46-6)，山奈素對照品(批號：14215-86-2)，芹菜素對照品(批號：520-36-5)，木犀草素對照品(批號：491-70-3)均購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于≥ 98%。

表1 漏蘆花藥材信息及4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實驗采用Welchrom-C18色譜柱(4.6mm×300mm，5μm)，流動相為乙腈(B)- 0.3%磷酸水(A)，梯度洗脫，0～30 min，1%～9% B；30～50 min，9%～14% B；50～110min，14%～17% B；110～150min，17%～19% B；流速1.0 mL/min，柱溫設(shè)為40 ℃，同時設(shè)置10 μL的進(jìn)樣量和254 nm的檢測波長。

2.2 制備混合對照品溶液

精密稱取對照品綠原酸、山奈素、木犀草素和芹菜素適量，置于5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，使綠原酸、山奈素、木犀草素和芹菜素的終濃度分別為9mg/μL、1.0304mg/μL、9.040mg/μL、0.344mg/μL。

2.3 制備供試品溶液

取過三號篩的漏蘆花粉末(約1.0g)，精密稱定后放于具塞錐形瓶，加入甲醇20 mL后密封，稱定重量后加熱回流0.5小時，待室溫放冷后，再次稱定重量，減失的重量使用甲醇補(bǔ)足，待搖勻、濾過后即得續(xù)濾液。

2.4 指紋圖譜測定

2.4.1精密度試驗

取漏蘆花藥材(X6)，按上述方法制備實驗用的供試品溶液，根據(jù)確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次進(jìn)樣的色譜圖、保留時間和分離度較好的峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD% 在 0.47%～0.87%，相對峰面積RSD% 在 0.67%～2.04%。將6次得到的色譜圖進(jìn)行相似度分析，相似度大于0.98，該結(jié)果說明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜測定的技術(shù)要求。

2.4.2穩(wěn)定性試驗

取漏蘆花藥材(X6)，將按上述方法制備的供試品溶液在 2、4、6、8、12、 24 h分別根據(jù)確定的色譜條件進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣的色譜圖、保留時間和分離度較好的峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD% 在 0.64%～0.73%，相對峰面積 RSD% 在 0.67%～1.85%。相似度分析后顯示相似度大于0.98，表示漏蘆花的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好，符合指紋圖譜測定的技術(shù)要求。

2.4.3重復(fù)性試驗

取漏蘆花藥材(X6)，將按上述方法制備的供試品溶液6份，在確定的色譜條件下平行進(jìn)樣，記錄各自的色譜峰。各共有峰相對保留時間 RSD% 在 0.24%～0.81%，相對峰面積RSD% 0.59%～1.94%。相似度大于0.95，說明該方法的重復(fù)性好，符合指紋圖譜測定的技術(shù)要求。

2.4.4指紋圖譜相似度評價

取漏蘆花藥材(X1～X11)，按上述方法制備的供試品溶液，在已經(jīng)建立的色譜條件下進(jìn)樣，記錄各自的色譜圖、保留時間和分離度較好的峰面積。將測定的漏蘆花11批次指紋圖譜導(dǎo)入到《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012A版)中，進(jìn)行相似度評價(圖1)，通過比較保留時間的方法，共標(biāo)定了17個共有特征峰，其中1～4特征峰分別為綠原酸、山奈素、木犀草素和芹菜素色譜圖見圖2和圖3。不同批次漏蘆花藥材以X6樣品為指紋圖譜作為參照圖譜，進(jìn)行相似度計算，結(jié)果11批漏蘆花藥材的相似度分別是0.996、0.985、0.969、0.976、0.982、0.957、0.954、0.967、0.988、0.979及0.975。說明11批漏蘆花藥材化學(xué)成分比較穩(wěn)定。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的統(tǒng)計結(jié)果，見表2、表3。

圖1 11批次漏蘆花藥材疊加的特征指紋圖譜

圖2 供試品HPLC圖譜

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜1-綠原酸; 2-山奈素; 3-木犀草素; 4-芹菜素

表2 11批漏蘆花相對保留時間

表3 11批漏蘆花相對峰面積

2.5 含量測定

2.5.1線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液5.0μL、7.5μL、10 μL、12.5μL、15.0μL，高效液相色譜儀進(jìn)樣后測定對照品的峰面積。分別以對照品溶液的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)X、峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)Y，計算線性回歸方程。結(jié)果得出，綠原酸：Y= 5978.3X- 30649，r= 0.9999，線性范圍為2.576～15.456μg；山奈素：Y= 97.825X+ 13391，r= 0.9993，線性范圍為2.25～13.5μg；木犀草素：Y= 7148.5X+ 26667，r=0.9998，線性范圍為0.226～1.356μg；芹菜素：Y=1975.2X+ 3354.8，r= 0.9997，線性范圍為0.086～0.516μg。

2.5.2精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10μL，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測定各對照品的峰面積值A(chǔ)，并統(tǒng)計分析。結(jié)果綠原酸、山奈素、木犀草素和芹菜素RSD%依次為0.58%、0.64%、1.12%和0.77%。說明該高效液相色譜儀的精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗

精密吸取X6供試品溶液10μL，分別于0、2、4、6、8、12、16、24h進(jìn)樣，測定各測定成分的峰面積值A(chǔ)，并統(tǒng)計分析。結(jié)果綠原酸、山奈素、木犀草素和芹菜素RSD%依次為1.29%、0.91%、0.69和1.41%。結(jié)果表明，該測定的供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.5.4重復(fù)性試驗

精密稱取樣品X6，按上述供試品溶液的制備方法制備6份，分別精密吸取10μL進(jìn)樣，測定其峰面積值A(chǔ)。結(jié)果顯示，綠原酸、山奈素、木犀草素和芹菜素RSD%依次為0.98%、1.10%、1.39和1.89%。

2.5.5準(zhǔn)確度試驗

取已知含量的樣品X6約0.5g，共9份，精密稱定，分三組按對照品加入量-樣品中含量0.5∶1、1∶1、1.5∶1的要求分別依次精密加入混合對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，再精密吸取供試品溶液10μL，進(jìn)樣后測定，并計算回收率。結(jié)果綠原酸、山奈素、木犀草素和芹菜素平均回收率(n=9)分別為98.7%(RSD%=3.36%)、97.68%(RSD%=3.18%)、101.25(RSD%=2.89%)和102.33(RSD%=3.74%)。

2.5.6樣品含量測定

取本品(X1～X11)粉末約1.0g，精密稱定，按2.3項下操作制成供試品溶液，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，并以外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表1。

3 討論

因本研究中含量測定的四種成分極性較大，故在供試品溶液的制備方法中分別比較了以甲醇、70%甲醇、50%甲醇為提取溶劑，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h提取時間，10∶1、20∶1、30∶1(mL/g)為料液比，超聲提取、加熱回流為提取方法，結(jié)果顯示：料液比為20∶1，溶劑為甲醇，加熱回流0.5h時分離度與峰面積值最優(yōu)。本研究對流動相的選擇進(jìn)行了對比，分別采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.3%磷酸水和乙腈-0.3%磷酸水作為流動相去梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動相采用乙腈-0.3%磷酸水時，樣品的分離效果最好。當(dāng)對各檢測波長的色譜圖進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)254nm波長處的色譜信息豐富、各測定的色譜峰分離度較好且穩(wěn)定。