高效液相色譜法同時(shí)測定不同來源柑橘幼果中10種類黃酮化合物和香豆素類化合物

岳 超，趙維良，郭增喜，劉 柱，張文婷

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,杭州 310052)

柑橘作為世界第一大水果,其品種繁多,資源豐富,在我國有著悠久的栽培歷史。柑橘中含有類黃酮、生物堿、揮發(fā)油、類檸檬苦素、香豆素等具有生理功能的微量物質(zhì)[1-2],如類黃酮化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎癥、鎮(zhèn)痛、抗凝血和預(yù)防心血管疾病等功效[3-5]。因此,柑橘已成為中醫(yī)藥學(xué)、功能食品、天然產(chǎn)物化學(xué)的研究熱點(diǎn)。柑橘屬植物生長過程中,會(huì)自然掉落一部分未成熟果實(shí),稱為生理落果。在栽培過程中,為實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化栽培還要進(jìn)行疏果,也會(huì)產(chǎn)生大量的未成熟的廢棄果實(shí)。這些未成熟廢棄果實(shí)為柑橘的開發(fā)利用提供豐富的資源,如中藥中的枳殼為酸橙及其栽培變種的未成熟果實(shí),枳實(shí)為酸橙和甜橙的生理落果。現(xiàn)有研究表明,柑橘幼果的部分生物活性物質(zhì)的含量高于成熟果實(shí)的[6],具有巨大的應(yīng)用潛力。

本工作根據(jù)文獻(xiàn)[7-9],采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)不同品種的柑橘幼果中的7種類黃酮化合物[4種黃烷酮物質(zhì)(蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷),1種黃酮苷類物質(zhì)(木樨草素),2種多甲氧基黃酮類物質(zhì)(川陳皮素、橘皮素)]和3種香豆素類化合物(橘皮內(nèi)酯水合物、橘皮內(nèi)酯、葡萄內(nèi)酯)含量進(jìn)行測定,并采用聚類分析的方法評(píng)價(jià)了不同品種橘果間的親疏關(guān)系,以期為充分利用柑橘資源、提高柑橘的綜合利用價(jià)值提供依據(jù),對(duì)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent-1100型高效液相色譜儀,配G1316A型柱溫箱、1314A 型紫外檢測器、1311A 型四元泵梯度和1313A 型自動(dòng)進(jìn)樣器;XPE 205 型電子天平;4020P型超聲波清洗器。

蕓香柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%,柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品純度為94.7%,橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品純度為95.3%,新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.6%,橘皮內(nèi)酯水合物標(biāo)準(zhǔn)品純度為98%,橘皮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品純度為98%計(jì),木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.9%,橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%,川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%,葡萄內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品由江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊武亮教授提供,純度為99.9%。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取適量目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇超聲溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶中,用甲醇稀釋配制成蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橘皮內(nèi)酯水合物、木犀草素、橘皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素和葡萄內(nèi)酯的質(zhì)量濃度分別為1 188.74,1 085.26,1 205.55,1 128.47,248.14,212.86,227.95,221.68,202.40,225.17 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:取適量各目標(biāo)化合物的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于20 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,得到含蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橘皮內(nèi)酯水合物、木犀草素、橘皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘皮素和葡萄內(nèi)酯的質(zhì)量濃度分別為46.59,162.80,34.45,112.35,1.82,6.26,4.47,1.09,1.01,1.12 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取0.02,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.50 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL 容量瓶中,用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇稀釋至刻度。

乙腈為色譜純,甲酸、甲醇均為分析純,試驗(yàn)用水為超純水;試驗(yàn)共采集6 種柑橘品種幼果,共13批樣品,均采收于6月底至7月初,并由浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院鑒定。樣品詳情見表1。

1.2 儀器工作條件

Extend XDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;檢測波 長330 nm;進(jìn)樣量10μL。流動(dòng)相:A 為乙腈,B 為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液;流量1.0 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～2 min時(shí),A 為10%;2～5 min時(shí),A 由10%升至18%,保持5 min;10～25 min時(shí),A 由18%升至20%;25～45 min時(shí),A 由20%升至50%;45～70 min時(shí),A 由50%升至100%。

1.3 試驗(yàn)方法

柑橘幼果樣品于60 ℃烘干,粉碎,過孔徑為0.45 mm 的篩網(wǎng),密封冷凍保存,備用。

取0.5 g處理好的柑橘幼果樣品于100 mL容量瓶中,加入90 mL 50%甲醇溶液,超聲30 min后,用50%甲醇溶液定容,以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液過0.45μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

表1 13批樣品信息表Tab.1 List of information about 13 batches of samples

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和S3 樣品溶液的色譜圖見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定,以10種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法檢出限(3S/N),結(jié)果見表2。

2.3 儀器精密度試驗(yàn)

按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測定6次,計(jì)算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橘皮內(nèi)酯水合物、木犀素、橘皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘皮素、葡萄內(nèi)酯峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.41%,0.75%,0.45%,0.55%,0.69%,0.78%,0.53%,0.57%,0.44%,0.61%;保留時(shí)間的RSD 分別為0.65%,0.41%,0.53%,0.28%,0.44%,0.52%,0.67%,0.42%,0.58%,0.60%。結(jié)果表明該儀器精密度良好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和S3樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and sample No.S3 solution

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法制備S3 樣品溶液,分別在放置0,4,8,12,16,20,24 h后進(jìn)樣。測得24 h內(nèi)樣品溶液中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橘皮內(nèi)酯水合物、木犀素、橘皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘皮素、葡萄 內(nèi)酯峰面積的RSD 分別為1.7%,0.47%,0.83%,0.52%,1.2%,1.1%,0.56%,0.48%,0.55%,1.1%。結(jié)果表明,樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法制備S3 樣品溶液6 份,并按照儀器工作條件測定,記錄色譜峰面積并計(jì)算其RSD。

測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橘皮內(nèi)酯水合物、木犀素、橘皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘皮素、葡萄內(nèi)酯峰面積的RSD 分別為1.2%,0.75%,1.2%,0.75%,0.55%,2.1%,0.78%,0.53%,1.2%,0.55%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性好。

2.6 回收試驗(yàn)

稱取已知含量S3樣品9份,向不同樣品中分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0,3.0,5.0 mL,制備得到3個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品,每個(gè)濃度水平平行制備3份,按照試驗(yàn)方法測定并計(jì)算回收率,結(jié)果顯示,蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橘皮內(nèi)酯水合物、木犀草素、橘皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘皮素和葡萄內(nèi)酯的回收率 分別為97.8%,101%,98.3%,96.8%,104%,102%,96.4%,105%,94.6%,95.6%。

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)13批樣品進(jìn)行測定,測定結(jié)果見表3。

由表3可知,在13批柑橘幼果中均檢出了蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和橙皮素。新橙皮苷和柚皮苷為常見的黃烷酮類物質(zhì)。新橙皮苷具有苦味,在甜橙和香櫞樣品中含量較低,新橙皮苷含量最多的為黃皮酸橙(S5),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.440%,其次為甌柑和朱欒(S10);柚皮苷在酸橙和黃皮酸橙中含量較高,最高可達(dá)11.940%(S4)。新橙皮苷和柚皮苷經(jīng)氫化后轉(zhuǎn)化成二氫查耳酮,甜度為蔗糖的300倍以上,因此,在甜味劑開發(fā)利用上,黃皮酸橙和甌柑優(yōu)勢明顯。樣品中蕓香柚皮苷和橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為0.466%～12.532%,朱欒中這兩種化合物含量均較高,其中,蕓香柚皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)10.960%(S10)。黃皮酸橙中香豆素類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和高于其他樣品的,最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.659%(S4),其次為酸橙和朱欒樣品;柑橘中香豆素是已被充分肯定的天然抗癌物質(zhì),因此黃皮酸橙在提取和開發(fā)天然抗癌藥物上存在優(yōu)勢。多甲氧基黃酮類物質(zhì)只天然存在于柑橘果實(shí)中,是柑橘屬的特征成分[10-11],甌柑中川陳皮素和橘皮素含量最高,黃皮酸橙(S4)次之。

2.8 多甲氧基黃酮類物質(zhì)的聚類分析

由于多甲氧基黃酮類物質(zhì)為柑橘屬的特征成分,對(duì)其測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,可以獲得不同橘果之間的親疏關(guān)系。以川陳皮素、橘皮素的測定結(jié)果為變量,用平均聯(lián)接(組間)的鏈接聚類方法,得到13批樣品的聚類樹狀圖,結(jié)果見圖2。

圖2 13批樣品聚類結(jié)果樹狀圖Fig.2 Dendrogram of clustering results of 13 batches of samples

由圖2聚類結(jié)果可知:甜橙樣品和其他樣品區(qū)別很大,可單獨(dú)歸為一類;香櫞及S4號(hào)黃皮酸橙樣品和除甜橙外的其他品種略有差別。該結(jié)果可用于中藥材,如枳實(shí)、枳殼的真?zhèn)舞b別,有區(qū)分不同栽培變種的應(yīng)用前景。

本工作采用HPLC 測定了13批不同品種、不同產(chǎn)地柑橘幼果中的10種化合物,以多甲氧基黃酮類物質(zhì)的測定結(jié)果為變量,采用鏈接聚類的方法對(duì)這些樣品的親疏關(guān)系進(jìn)行了劃分。該方法重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高,可為綜合利用落果和“摘青”的未成熟果實(shí)及柑橘屬藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù),也可以為柑橘屬藥材的真?zhèn)舞b別提供技術(shù)支持。