高效液相色譜-質譜法對冠心病患者血清的脂質組學研究及其臨床意義

王真昕，申華莉，楊芃原

(1.復旦大學 上海醫學院 生物醫學研究院,上海 200032;2.復旦大學 附屬中山醫院 檢驗科,上海 200032;3.復旦大學 附屬閔行醫院,上海 201199;4.復旦大學 化學系,上海 200433)

采用現代分析方法進行臨床醫學樣本的分析檢驗已經成為生命科學中的一個重要領域,并已形成基因組學、蛋白質組學、脂質組學等分支學科,具有極大的臨床醫學價值。2003年,文獻[1]根據生命新陳代謝過程會產生一系列脂質分子這一現象,提出了脂質組學概念。2014年,Nature發表了一系列針對脂質組學的評述[2-7],標志著脂質組學同基因組學、蛋白質組學一起,已經發展成為了生命科學領域的一個分支學科。脂質是一類具有疏水性或親水親油兩親性的小分子,已知的脂質分子有十萬多種。人體血液中的脂質為人體新陳代謝紊亂的產物,而非過量飲食油脂形成的的剩余產物,它是一個由多種脂質分子形成的集合體。當血液中的脂質沉積在血管壁上形成斑塊并導致血管堵塞時,就形成了動脈粥樣硬化,這種疾病是冠心病(CAD)的早期病理現象。其冠狀動脈閉塞持續時間不小于3個月,且存在0級血流的心肌梗死(TIMI)的患者被定義為冠狀動脈慢性完全堵塞(CTO)患者,這類患者占所有冠心病患者的三分之一。這類疾病危險性大、且死亡率高。近年來,CTO 發病人數逐年增多,嚴重影響人民的生活質量,但是CTO 存在發病機制復雜、病因目前仍未闡明、預后較差且沒有較為有效的治療手段和藥物等問題。針對這一現狀,可采用現代分析方法尋找突破口。高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)因適合微量醫學樣本中生命物質、藥物和代謝產物的檢測而備受注目,目前在生物醫學試樣血樣、尿樣的檢測與疾病相關的蛋白質、藥物等的檢測中已有應用[8-10]。

組學研究中,Shotgun法能夠在海量的組學分子中最大限度地獲取試樣中的組學分子信息,是組學研究中首選的分析方法[11]。而Shotgun法的缺點是在進行質譜檢測時,可能有部分中性分子被歧視而“丟失”,從而導致漏檢。為此,試驗采用多反應監測(MRM)法對中性脂質分子進行了補充檢測。據此,本工作采用HPLC-MS對患者血清試樣進行了脂質組學研究,將Shotgun法與MSM 法相結合,探查了患者在不同病患階段時血清試樣中脂質分子組成[如磷脂酰乙醇胺類化合物(PE)、磷脂酰膽堿類化合物(PC)、磷脂酰絲氨酸類化合物(PS)、磷脂酰甘油類化合物(PG)、磷脂酰肌醇類化合物(PI)、磷脂酸類化合物(PA)、溶血磷脂酰膽堿類化合物(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺類化合物(LPE)、膽固醇酯類化合物(CE)、三酰基甘油類化合物(TAG)、二酰基甘油類化合物(DAG)和鞘磷脂類化合物(SM)]的變化,從中找出與疾病發展密切相關的標志性脂質分子,并將這些脂質分子標志物應用于冠心病的臨床診斷的早期預測以及手術后風險預測的評估,以期為脂質組學在CTO 臨床醫學中的應用提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-20AB HPLC 系 統;AB Sciex 6500 QTRAP型三重四極桿線性離子阱質譜系統;5810R 型離心機。

混合脂質內標溶液:由PE 15∶0/18∶1(d7)、PC 15∶0/18∶1(d7)、PS 15∶0/18∶1(d7)、PG 15∶0/18∶1(d7)、PI 15∶0/18∶1(d7)、PA 15∶0/18∶1(d7)、LPC 18∶1(d7)、LPE 18∶1(d7)、CE 18∶1(d7)、DAG 15∶0/18∶1(d7)、TAG 15∶0/18∶1(d7)/15∶0和SM 18∶1(d9)組成。

杜爾貝科磷酸鹽緩沖溶液(DPBS),pH 為7.2。

異丙醇、甲醇、正己烷均為質譜純;甲酸、氯仿、乙酸銨均為色譜純;磷酸、氯化鉀為分析純。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 用于Shotgun法測定

電噴霧離子源(ESI),進樣流量為10μL·min－1;正、負離子噴霧電壓分別為5,－4.5 kV;掃描方式為母離子(PI)掃描結合中性丟失粒子(NL)掃描,掃描速率質荷比(m/z)200/s,掃描范圍m/z400～1 000。

1.2.2 用于MSM 法測定

1)色譜條件 Phenomenex硅膠柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫25 ℃;進樣量10μL;流量300μL·min－1;流動相:A 為體積比為58∶40∶2的異丙醇-正己烷-100 mmol·L－1乙酸銨溶液的混合溶液,B為體積比為50∶40∶10異丙醇-正己烷-100 mmol·L－1乙酸銨溶液的混合溶液。梯度洗脫程序:0～10 min 時,B 由50%升至100%,保持10 min;20～21 min時,B 由100%降至50%,保持9 min。

2)質譜條件 ESI;正、負離子噴霧電壓分別為5,－4.5 kV;MRM 模式;掃描范圍m/z400～1 000。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本采集

將采集的樣本分為四組:CTO 疑似人群(對照組)、CTO 患者組、CTO 患者在經皮冠狀動脈介入治療(PCI)手術后24 h 組,以及CTO 患者在PCI手術后72 h組(后3組分別對應PCI手術前、手術中和手術后,醫學上統稱“圍術期”)。采集的全血血樣在室溫下靜置1 h后,以3 000 r·min－1轉速離心10 min,分離上層血清,在－80 ℃下冷凍儲藏。

1.3.2 血清中脂質的提取

1)用于Shotgun法的脂質提取 將血清放在液氮中解凍并平衡至室溫,搖動混勻。分取200μL血清于10 mL帶有聚四氟乙烯蓋帽的玻璃管中,每個樣品加入10μL混合脂質內標溶液,再加入體積比為10∶10∶1的甲醇-氯仿-甲酸的混合溶液,于－20 ℃下靜置過夜。最后加入含有1 mol·L－1氯化鉀溶液 的0.2 mol·L－1磷酸溶 液2.2 mL,以3 000 r·min－1的轉速離心5 min,靜置,離心管中的樣品溶液分成三層。用玻璃滴管穿過上層甲醇相,吸取含有脂質的中層相于另一個玻璃離心管中,再用1 mL三氯甲烷洗滌上層甲醇相,重復上述步驟兩次,合并中層相。在室溫下以溫和的氮氣氣流吹干中層相,用1 mL流動相A 復溶,以12 000 r·min－1轉速于4 ℃下離心45 min,按照1.2.1節儀器工作條件分析上清液。

2)用于MRM 法的脂質提取 將血清放在液氮中解凍并平衡至室溫,加入10μL 的混合脂質內標溶液后,再將血清在液氮中反復凍融5 次,加入2 mL DPBS和2 mL體積比為25∶75的乙酸乙酯-異辛烷混合溶液,以1 000 r·min－1的轉速離心5 min。用玻璃滴管吸取上層含有脂質的乙酸乙酯-異辛烷相到另一個玻璃離心管中,用1 mL 體積比為25∶75 的乙酸乙酯-異辛烷混合溶液洗滌下層DPBS相,重復上述步驟兩次,合并乙酸乙酯-異辛烷相。用溫和的氮氣氣流吹干乙酸乙酯-異辛烷相。加入1 mL含有100 mmol·L－1氫氧化鋰溶液的甲醇復溶,以12 000 r·min－1轉速于4 ℃下離心45 min。按照1.2.2節儀器工作條件分析上清液。

2 結果與討論

2.1 質譜數據的脂質數據庫檢索和檢索結果

用Shotgun法對脂質提取上清液進行分析,通過儀器自帶軟件Analyst 1.6對質譜獲得的脂質數據進行脂質數據庫檢索,并通過生物信息學工具“Lipid MS Predict”[12]確認脂質分子。結果發現:在4組樣本中總共鑒定得到1 504種脂質分子,確定了鏈長在15～65(碳原子數)之間的脂肪酸側鏈分布。其中,CTO 患者組血清中的TAG 類化合物含量上升、DAG 類化合物含量下降;其中具有C14∶1、C18∶2和C19∶0脂肪酰基鏈的分子被鑒定為具有標志性差異的脂質分子,特別是C14∶1,其在CTO 患者組中降低特別顯著,術后其含量趨于正常。對于CTO 疑似人群及PCI手術前、手術中及手術后的CTO 患者,對應血清中的脂肪酰基在圍術期的不同時段存在明顯的變化趨勢[13],具有顯著的識別作用。

2.2 脂質組學研究結果及其臨床醫學意義

用MRM 法進一步對脂質提取上清液分析,共獲得631個具有臨床意義的脂質分子,包括在正離子模式下檢測得到的403個脂質分子(以PA、CE、PE、PC和SM 類化合物為主),和在負離子模式下檢測得到的228個脂質分子(以PS、PI和PG 類化合物為主)[12]。

對CTO 早期診斷及CTO-PCI手術后風險預測密切相關的脂質主要是DAG、PA、PC 以及SM類化合物。采用變量投影重要性(VIP)準則進行統計分析并篩選出對區分效果貢獻較大的標志性差異脂質分子,在篩選出的210個標志性差異脂質分子中,VIP值最高的3個脂質分子分別為PA 10∶0/19∶0、LPE 18∶0以及CE 16∶1,這3個脂質分子對于PCI手術前、中、后等3樣本的區分具有標志性的作用。VIP 值最高的15 個差異脂質分子中,LPE類化合物占5個,均在CTO 對照組中呈高水平分布,但它在CTO 患者中的分布下降,在PCI手術后的分布降至最低。與之相反的是,CE 類化合物在CTO 患者血清中的分布水平都顯著高于對照組的。

通過受試者工作特征(ROC)曲線進行分類評價,得到179個評價曲線下的積分面積(AUC)大于0.6的脂質分子,這些分子對于CTO 具有高診斷價值,尤其是積分面積大于0.9 的9 個脂質分子,即LPE 18∶1、LPE 18∶0、CE 16∶1、LPE 18∶2、PC 34∶2、LPE 17∶0、神經酰胺Cer 18∶1/24∶1、SM 18∶1/16∶0以及SM 18∶1/18∶0,對早期診斷、判定具有確切價值。

結合臨床回訪結果和脂質組學分析數據,可以發現:與預后良好的CTO 患者相比,預后不良的CTO 人群存在術前PA 類化合物升高,PC 類化合物降低。尤其是PA 的升高與預后不良呈正相關。PA 18:3/19∶0、PA 17∶2/20∶1以及PA 13∶0/18∶1升高的患者在手術后更加趨向于發生心肌損傷或者發生血管再狹窄。從術后脂質分布水平來看,術后CE分布水平的差異可預示不同的中長期預后情況,CE 16∶1、CE 24∶0升高或CE 19∶0下降的患者預后趨于不良。這些結果對術后風險預測具有實際的臨床醫學意義。

本工作采用HPLC-MS研究了CTO 疑似人群及CTO 患者在手術前、手術中和手術后的血清樣本,對得到的質譜數據進行了質譜庫檢索。利用脂質組學研究確認了標志性脂質分子,結果對心血管疾病的臨床早期診斷和手術后風險預測具有明確的指導意義。