高效液相色譜法快速測定果蔬脆片中苯并(a)芘殘留量

(濰坊海關,濰坊 261041)

果蔬脆片是以蔬菜、水果為主要原料,經過真空油炸生產制作的食品,其制作工藝最大程序地保存了果蔬的原味和營養成分,被認為是一種綠色食品,深受消費者的喜愛。由于經過了植物油油炸過程,果蔬脆片中的含油量一般在20%以上。油脂在高溫重復使用時會產生苯并芘,如果使用這類植物油炸制果蔬脆片,其中的苯并芘會隨著油炸過程遷移到果蔬脆片中。苯并(a)芘是常見的苯并芘,由5個苯環組成,結構穩定難以降解,屬于高致癌物和突變原。動物試驗證明,苯并(a)芘具有致癌、致畸和致突變性,其在食品、油脂、水體和土壤中廣泛存在[1]。文獻[2]對市售的50 種不同植物油進行檢測,在18個樣品中檢出苯并(a)芘,檢出率高達36%,其質量分數為0.69～31.72μg·kg－1。2019年7 月和8月,韓國食品藥品安全處分別因苯并(a)芘超標問題[韓國標準規定苯并(a)芘限量為10μg·kg－1],命令日本HATANO SUISAN 公司停止銷售并召回鰹魚粉產品,韓國世林糙米(株)公司停止銷售并召回其銷售的“樂溫糙米油”產品。因此,非常有必要建立油脂產品中殘留苯并(a)芘的測定方法,用于指導我國相關進出口企業原料產品檢驗,從而保護消費者的身體健康。

目前,測定苯并(a)芘的方法主要有高效液相色譜法[3-6]和液相色譜-質譜法[7-8]。高效液相色譜法是檢測苯并(a)芘的通用方法,附帶的熒光檢測器具有高靈敏度的特點,可以滿足國家標準對食品中苯并(a)芘殘留的限量要求。液相色譜-質譜法在測定苯并(a)芘時有一定的局限性,如文獻[2]采用大氣壓光致電離源作質譜離子源,其檢測靈敏度不如高效液相色譜法高,且這種離子源在常規質譜測定中使用較少,經濟性、應用性和推廣性均不足。但采用食品安全國家標準GB 5009.27－2016《食品安全國家標準 食品中苯并(a)芘的測定》中的液相色譜法測定苯并(a)芘時,由于果蔬脆片含油量高且成分復雜,苯并(a)芘的基質加標回收率低、結果重現性差,因此需要建立一種高效地提取凈化苯并(a)芘的方法來滿足對復雜油脂產品中苯并(a)芘殘留量進行測定的需求。苯并芘分子印跡柱是一種親和柱,其中特殊的分子結構和官能團可以選擇性的吸附富集苯并芘,進而達到提取凈化的目的[9],據此,本工作建立了一種適用性強的苯并(a)芘提取凈化方法,以期為食品生產企業及相關監管部門對苯并(a)芘含量的監控提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜,配熒光檢測器;5810R 型冷凍離心機;LB-W-48 型水浴氮吹儀;Milli-Q Reference型超純水系統;GM 300 型樣品研磨儀;Visiprep TM DL 型固相萃取裝置;XS 205DU 型電子天平;苯并(a)芘分子印跡柱(500 mg/6 mL)。

苯并(a)芘標準儲備溶液:100.0 mg·L－1,稱取苯并(a)芘標準品0.010 0 g,用乙腈溶解并定容至100.0 mL,于－20℃環境下保存,有效期6個月。

苯并(a)芘標準溶液:1.0 mg·L－1,移取苯并(a)芘標準儲備溶液1 mL,用乙腈定容至100.0 mL,于4 ℃保存,有效期3個月。

苯并(a)芘標準工作溶液系列:用樣品溶液將苯并(a)芘標準溶液稀釋至0.4,5,10,50,80,100μg·L－1,現用現配。

苯并(a)芘標準品的純度大于99.7%;正己烷、二氯甲烷、乙腈和甲酸均為色譜純;試驗用水為一級水。

1.2 儀器工作條件

Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5.0μm),柱溫40℃;熒光檢測器激發波長384 nm,發射波長406 nm;流動相體積分數為90%的乙腈溶液,等度洗脫;流量1.0 mL·min－1;進樣體積10μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

稱取粉碎均勻的果蔬脆片樣品5.00 g,轉移至50 mL具塞離心管中,加入20 mL正己烷渦旋振蕩1 min,靜置5 min 后再渦旋振蕩1 min,以10 000 r·min－1轉速于4 ℃冷凍離心10 min,移取上清液16.0 mL至20 mL玻璃試管中,待用。

1.3.2 苯并(a)芘分子印跡柱的活化

在苯并(a)芘分子印跡柱中加入二氯甲烷5 mL,靜置1 min后加入正己烷5 mL,完成對凈化柱的活化。

1.3.3 樣品的測定

將玻璃試管中溶液加入活化好的凈化柱中,用正己烷3 mL 淋洗柱子,用二氯甲烷6 mL 洗脫,洗脫液收集到10 mL試管中,于35 ℃氮吹至近干,加入乙腈1 mL溶解殘渣,渦旋振蕩1 min,過0.22μm有機濾膜,濾液供高效液相色譜分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

試驗考察了Eclipse Plus C18色譜柱規格分別為(100 mm×4.6 mm,3.0 μm)、(150 mm×4.6 mm,5.0μm)和(250 mm×4.6 mm,5.0μm)時對測定的影響。結果顯示:在使用第一種色譜柱時,柱壓較高,分析物的保留時間較短,且分析物的色譜峰和雜質峰不易分離;在使用第三種色譜柱時,柱壓也較高,雖然分析物的色譜峰和雜質峰能有效分離,但保留時間為16 min,不利于樣品的批量快速測定;在使用第二種色譜柱時,不僅分析物能得到有效分離,且保留時間較短(8 min 左右),故試驗選擇Eclipse Plus C18色譜柱的規格為(150 mm×4.6 mm,5.0μm)。

試驗進一步考察了流動相中的有機相分別為甲醇和乙腈時對分析物的保留時間和分離效果的影響。結果顯示:以甲醇作為有機相時,分析物保留時間較長,且其峰高比乙腈作有機相時的低15%。這是由于乙腈極性較甲醇的略小,其洗脫能力更強,可縮短測定時間;同時,在同等條件下,苯并(a)芘在乙腈中受紫外照射時產生的熒光強度比在甲醇中的更高,故其響應值更高。因此試驗采用乙腈作流動相中的有機相。

試驗在參考文獻的基礎上,還考察了流動相乙腈和水的體積比分別為70∶30[4]、80∶20[5]、88∶12[9]、90∶10 和92∶8 時對測定的影響。結果顯示:隨著有機相所占比例的增加,分離效果變好;但當有機相的體積分數大于90%時,目標物的保留時間延長、雜峰增多,分析物峰出現拖尾,且響應值降低。綜合考慮,試驗選擇體積分數為90%的乙腈溶液作流動相。

按照1.2節優化的色譜條件對0.4μg·L－1苯并(a)芘標準溶液進行測定,得到的色譜圖見圖1。

2.2 提取條件的選擇

圖1 苯并(a)芘標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of benzo(a)pyrene standard solution

目前國家標準和文獻報道的苯并(a)芘的提取溶劑主要有乙腈[4]、正己烷[10-11]、乙酸乙酯-環己烷[2]、環己烷[12-13]、辛醇-四丁基溴化銨[14]和石油醚[15],故試驗考察了上述溶劑對苯并(a)芘加標量為10.0μg·kg－1的果蔬脆片進行提取時對測定的影響。結果顯示:使用甲醇、乙腈或辛醇-四丁基溴化銨提取時,苯并(a)芘的回收率低于60%;使用乙酸乙酯-環己烷和石油醚提取時,苯并(a)芘的回收率達到了75%以上,但色譜圖上的干擾峰較多;使用正己烷和環己烷提取時的提取效果最好,回收率均達到85%以上,考慮到還需使用正己烷進行下一步的凈化操作,故試驗選用正己烷作為提取溶劑。

2.3 凈化方法的選擇

試驗比較了Qu ECh ERS 粉[16]、中性氧化鋁柱和苯并(a)芘分子印跡柱的凈化效果。結果發現,在使用苯并(a)芘分子印跡柱進行凈化時,分析物的分離效果和回收率均較好;而在使用QuEChERS粉、中性氧化鋁柱進行凈化時,分析物色譜圖上產生了較多雜峰,且回收率也較低。這是由于QuEChERS粉和中性氧化鋁均是通過吸附樣品提取液中的雜質來達到凈化目的的,凈化后的樣品溶液中分析物含量較低,需要進一步濃縮才能進行測定;而分子印跡柱是通過吸附苯并(a)芘到固相柱上,再通過洗脫劑將苯并(a)芘置換出來而達到凈化目的的,因此選擇分子印跡柱作凈化柱,凈化過程更加直接高效,且準確度更高。

試驗還考察了洗脫劑分別為二氯甲烷、三氯甲烷、正丁醇和異丙醇時對測定的影響。結果發現,采用正丁醇作洗脫劑時,分析物的回收率偏低;采用二氯甲烷、三氯甲烷和異丙醇作為洗脫劑時,苯并(a)芘的回收率都比較理想。考慮到二氯甲烷毒性最小、沸點最低且容易獲取,故試驗選擇用二氯甲烷作洗脫劑。

試驗還發現,若將提取液全部上柱凈化,提取液中的微小雜質或顆粒容易堵塞凈化柱,造成凈化時間延長或凈化過程失效等問題,而僅定量移取上清液進行凈化,凈化效率明顯提升。同時,在分子印跡柱活化操作中增加靜置1 min這一步驟,可以顯著增強苯并(a)芘回收率的穩定性和平行性。

2.4 工作曲線和測定下限

按照試驗方法對苯并(a)芘標準工作溶液系列進行測定,以苯并(a)芘的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結果顯示:工作曲線線性范圍為0.4～100μg·L－1,線性回歸方程為y＝1.810×10－2x－7.710×10－3,相關系數為0.999 9。

按照試驗方法對6個加標量為5.00μg·kg－1的空白果蔬脆片樣品進行測定,以10倍信噪比(S/N)計算方法的測定下限(10S/N),所得結果為0.40μg·kg－1。

2.5 精密度和回收試驗

在空白果蔬脆片樣品中添加低、中、高等3個濃度水平的苯并(a)芘標準溶液,按試驗方法測定,每個濃度水平做6個平行樣,連續測定6 天,計算日內、日間回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。

表1 精密度和回收試驗結果Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1結果可知:苯并(a)芘的日內回收率為89.4%～93.7%,RSD 為4.3%～7.2%;日間回收率為87.6%～92.5%,RSD 為5.8%～8.4%。

2.6 樣品分析

按照試驗方法對20個果蔬脆片樣品進行測定,結果顯示,在7個樣品中檢出了苯并(a)芘,其質量分數為1.34～7.20μg·kg－1,符合GB 2762－2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》對油脂及其制品中苯并(a)芘限量(10μg·kg－1)的要求。

本工作建立了高效液相色譜法測定果蔬脆片中苯并(a)芘殘留量的方法,該方法靈敏度高、抗干擾能力強,具有簡便、快速、實用性好等優點,可以滿足相關食品企業及國內外監管部門的檢測需求,也可為GB 5009.27－2016提供有效的技術補充。