二氫歐山芹通過調(diào)節(jié)自噬保護高糖誘導的足細胞損傷

師朗 宋志霞，2 張雅飛

1三峽大學第一臨床醫(yī)學院，宜昌 443003； 2宜昌市中心人民醫(yī)院腎內(nèi)科 443003

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病病程發(fā)展中的一種破壞性微血管的并發(fā)癥，其發(fā)病特征以持續(xù)性蛋白尿、腎小球濾過率受損及腎功能進行性下降為主[1]。相關研究表明終末期腎病病因中DN占比高達40%[2]。最近的一項研究表明，在北京和上海等大城市，慢性腎臟病病因分析中，糖尿病相關性腎臟病所占比例超過了腎小球腎炎[3]。目前，臨床上對DN的發(fā)生和發(fā)展尚無特效措施，仍有大量患者進展為終末期腎病，給患者及社會造成很大的經(jīng)濟負擔。因此，深入探究DN的發(fā)病機制，開發(fā)相關預防或延緩DN進展的治療策略十分重要。

DN發(fā)生發(fā)展的機制截至目前尚未完全闡明，傳統(tǒng)觀點認為與腎小球濾過屏障受損嚴重程度有關[4]。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，位于腎小球基底膜的外側[5]。我們課題組及其他學者的研究證實，足細胞損傷可能是促進DN的發(fā)生和發(fā)展的重要原因[6-7]。由于足細胞為終末分化細胞，幾乎無再生能力，因此，細胞內(nèi)降解系統(tǒng)對維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定就顯得尤為重要。自噬是細胞降解異常細胞內(nèi)物質(zhì)過程的統(tǒng)稱，其作為細胞內(nèi)降解系統(tǒng)，是一種保守的穩(wěn)態(tài)過程，在各種條件下對維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關重要[8]。早期研究表明，自噬與多種代謝性疾病相關，且在調(diào)節(jié)哺乳動物的糖脂代謝中發(fā)揮重要作用[9]。最近研究表明，自噬異常亦與足細胞損傷有關，可能是DN大量蛋白尿的重要機制[10-11]。

二氫歐山芹(columbianetin，CBT)屬于呋喃香豆素類化合物，最早從中藥材獨活中分離出來的[12]。目前已證實CBT廣泛存在于獨活、當歸等多種藥用植物中，且在獨活中的含量較多，是其主要質(zhì)量控制成分[13-14]。藥理研究表明CBT具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等作用[15]。另外，CBT被證明具有抑制巨噬細胞活化，穩(wěn)定肺泡巨噬細胞的分離，誘導結腸癌細胞凋亡和壞死等作用[16]。CBT還可以誘導細胞色素的RNA和蛋白表達，同時足細胞中細胞色素蛋白的釋放參與了足細胞損傷[17-18]。由此可以看出 CBT在疾病治療中起重要作用，且對足細胞的損傷有一定作用，但目前CBT與DN的相關研究報道較少。本研究擬探討CBT對高糖誘導的足細胞損傷是否有保護作用，其機制是否與調(diào)節(jié)自噬有關。

材料與方法

一、材料

小鼠永生系足細胞MPC5由上海酶研科技有限公司提供。二氫歐山芹購自北京百奧萊博科技有限公司。

胎牛血清(北京百奧萊博科技有限公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司)?？贵wNephrin、Podocin、Beclin-1、Desmin、P62、p-JNK(CST公司，美國)；羊抗兔二抗(Santa Cruz公司，美國)。GFP-LC3-Ⅱ質(zhì)粒(賽默飛科技中國有限公司)，TLR4 siRNA(sc-156001)、control siRNA、SP600125(sc-200635)及轉染試劑購自Santa Cruz公司。

二、方法

1.足細胞培養(yǎng) 將永生性小鼠足細胞系MPC-5在含有10% FBS和100 U/mL IFN-γ的PMI-1640培養(yǎng)基中在33℃，5% CO2條件下培養(yǎng)增殖，然后在37℃，5% CO2條件下在無IFN-γ的RPMI-1640中孵育14 d，誘導細胞分化。

2.蛋白質(zhì)印跡法 MPC-5細胞在冷RIPA緩沖液中裂解，用10%SDS-PAGE分離蛋白，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)。再用含5%脫脂奶粉的磷酸緩沖鹽溶液在4°C孵育3 h，4°C與所用一抗孵育過夜，再與熒光標記的二抗在37°C孵育1 h，采用化學發(fā)光法進行檢測并采用Image-Pro plus軟件(Media Controbernetics Inc，Rockville，MD)分析相關蛋白的表達，選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為內(nèi)參照。

3.免疫熒光 吸取100 μL細胞懸液加至6孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。待細胞貼壁后，將足細胞傳代種植于96孔板上，細胞貼壁融合達 60%后，以DMEM培養(yǎng)基孵育，以脂質(zhì)體Lip 2000轉染 GFP-LC3-Ⅱ質(zhì)粒，按照說明書每孔加入4 g/mL 濃度的 GFP-LC3-Ⅱ質(zhì)粒轉染 6 h 后，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后分別予以 5.0 mmol/L、30.0 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下觀察足細胞自噬情況。

4.siRNA轉染 用脂質(zhì)體Lip2000將TLR4 siRNA導入足細胞中，具體操作步驟按Lipofectamine 2000說明書進行。將生長狀態(tài)良好的細胞均勻地接種在6孔板上，培養(yǎng)過夜后細胞融合達60%，換為Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。TLR4 siRNA與Lipo 2000的稀釋液混勻后常溫靜置20 min，加入孔板中，4 h后加入DMEM培養(yǎng)液、無關片段轉染復合物或TLR4 siRNA(40 nmol/L)轉染復合物，轉染后48 h后進行后續(xù)實驗。

三、統(tǒng)計學方法

采用GraphPad 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以Mean±SD表示，多組之間比較采用單因素方差分析檢驗，獨立樣本采用t檢驗；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、高糖誘導足細胞損傷及自噬水平下降

首先把足細胞分為正常濃度組：NG(5 mmol/L)、高糖組：HG(30 mmol/L)和甘露醇滲透壓對照組：NG+M(5 mmol/L+25 mmol/L)進行處理，然后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1、P62等相關蛋白表達，結果顯示，與正常濃度組相比，甘露醇滲透壓對照組相關檢測蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。而高糖組Nephrin、Podocin表達顯著下降，Desmin表達升高，說明高糖刺激足細胞引起足細胞損傷。而P62表達明顯增高、Beclin-1表達則顯著下降，表明高糖可抑制足細胞自噬。(圖1)

二、2.2 CBT 對高糖誘導的足細胞損傷及自噬的影響

為了探討CBT對足細胞損傷及自噬的影響，首先設定天然提取物CBT濃度梯度為0.5μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，80 μg/mL，以Beclin-1為觀察指標，觀察到自噬增強較為明顯的濃度為20 μg/mL，且20～80 μg/mL之間無明顯差異，固選用20 μg/mL為實驗濃度(圖2A、2B)。然后把足細胞分為正常濃度組：NG(5 mmol/L)、高糖組：HG(30 mmol/L)和CBT組：HG+CBT(30 mmol/L+20 μg/mL)進行處理，再采用蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析結果顯示與高糖組相比，CBT處理后足細胞Nephrin、Podocin蛋白表達顯著升高，Desmin蛋白表達下降，表明CBT可抑制足細胞損傷。同時P62蛋白表達下降、Beclin-1表達升高，表明 CBT可誘導足細胞自噬。(圖2C、2D)

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；M：甘露醇；αP<0.05，bP>0.05。圖1 NG、NG+M和HG各組足細胞相關蛋白、損傷標志物和自噬相關標記物的表達 1A.足細胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)；1B、1C.圖1A定量分析

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹；aP<0.05，bP>0.05。圖2 NG、HG和HG+CBT各組足細胞相關蛋白、損傷標志物和自噬相關標記物的表達 2A.不同濃度CBT組Beclin-1蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法印跡)；2B.圖2A定量分析；2C.足細胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)；2D、2E.圖2C定量分析

三、CBT可上調(diào)TLR4、P-JNK的表達

已有研究證實，TLR4在糖尿病患者高糖誘導炎癥反應中起關鍵作用。本研究檢測了CBT對足細胞內(nèi)TLR4表達及p-JNK磷酸化水平的影響。結果顯示，與正常濃度葡萄糖組相比，CBT可顯著促進足細胞內(nèi)TLR4蛋白表達以及p-JNK蛋白磷酸化激活。說明CBT可通過TLR4/ P-JNK信號通路發(fā)出信號。(圖3)

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹；aP<0.05。圖3 NG、HG和HG+CBT各組TLR4及p-JNK蛋白的表達 3A.足細胞TLR4及p-JNK蛋白的表達(蛋白質(zhì)印跡法)；3B.圖3A定量分析

四、siRNA TLR4阻斷CBT的保護作用

TLR4 siRNA抑制TLR4表達同時可抑制的p-JNK蛋白激活(圖4A、4B)。按預設分組處理足細胞，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1、P62等相關蛋白表達，結果顯示，相比于CBT組，加入TLR4 siRNA(40 nmol/L)能使Nephrin、Podocin表達顯著下降，Desmin表達升高，說明TLR4 siRNA能夠有效地阻斷CBT對高糖誘導的足細胞損傷的保護作用。同時P62蛋白表達升高、Beclin-1表達下降，表明TLR4 siRNA也阻斷了CBT誘導足細胞自噬的作用(圖4C、4E)。

五、JNK抑制劑SP600125阻斷CBT的保護作用

為了進一步探討TLR4/p-JNK信號通路對CBT保護足細胞的影響，我們加用JNK酶特異性抑制劑SP600125(10 μmol)。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測及定量分析Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1、P62 等相關蛋白表達，結果顯示SP600125亦阻斷了CBT對高糖誘導的足細胞損傷的保護作用，足細胞中Nephrin、Podocin及Beclin-1蛋白表達顯著下降，同時Desmin及P62蛋白表達顯著增高，該結果提示CBT通過TLR4/p-JNK調(diào)節(jié)自噬，進而改善高糖誘導的足細胞損傷。(圖5)

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹;aP<0.05。圖4 NG、HG、HG+CBT和HG+CBT+TLRsiRNA各組足細胞相關蛋白、損傷標志物、自噬相關標記物及TLR4等蛋白的表達 4A.對照組及TLR4沉默組TLR4和p-JNK蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)；4B.圖4A定量分析；4C.足細胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)；4D、4E.圖4C定量分析

注：NG：正常濃度葡萄糖；HG：高糖；CBT：二氫歐山芹;aP<0.05。圖5 NG、HG、HG+CBT和HG+CBT+SP600125各組足細胞相關蛋白、損傷標志物及自噬相關標記物蛋白的表達 5A.足細胞Desmin、Nephrin、Podocin、Beclin-1和P62蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)；5B、5C.圖5A定量分析

六、實驗各組LC3-Ⅱ的表達情況

LC3-Ⅱ是自噬體標記物。我們進一步使用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3-Ⅱ轉染后各組細胞染色熒光顆粒情況，結果顯示高糖可以明顯抑制足細胞自噬標志物LC3-Ⅱ的熒光強度，提示高糖抑制足細胞自噬。而CBT能夠促進足細胞自噬發(fā)生，起到細胞保護作用。與CBT組相比，TLR4 siRNA及SP600125組中足細胞的LC3-Ⅱ熒光顆粒數(shù)目明顯減少，強度減弱明顯，表明CBT通過TLR4、p-JNK途徑誘導足細胞自噬。(圖6)

圖6 各組足細胞內(nèi)和LC3-Ⅱ蛋白的表達(免疫熒光 40×)

討 論

DN是世界范圍內(nèi)最重要的健康問題之一，并且在未來幾十年內(nèi)持續(xù)惡化[19]。研究表明足細胞在蛋白尿的發(fā)病機制和DN的進展中起重要作用[20]。DN進展過程中的高血糖往往導致足細胞損傷、脫落、數(shù)目下降，進一步導致蛋白尿的形成，其中足細胞損傷是蛋白尿的主要標志[21]。足細胞由Nephrin和Podocin等裂孔隔膜蛋白連接，組成腎小球濾過蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)的主要屏障[22]。有研究證實當Nephrin基因表達發(fā)生變化時，腎濾過膜結構和屏障功能的完整性受到影響，最終導致蛋白尿的產(chǎn)生[23]。Desmin 蛋白在機體正常時并不表達，而當腎小球足細胞嚴重受損時可大量表達[24]。另外有研究證明蛋白尿與足細胞特異性蛋白Nephrin和Podocin的減少有關，Nephrin、Podocin及其mRNA表達隨足細胞損傷而降低[25]?？梢奛ephrin、Podocin及Desmin等相關蛋白的表達與DN蛋白尿形成密切相關。我們研究發(fā)現(xiàn)，高糖組小鼠足細胞內(nèi)Nephrin、Podocin表達顯著下降，Desmin表達顯著升高，提示高糖可引起足細胞損傷，這一結果與以上研究一致。

細胞自噬在細胞維持自身代謝需要和某些細胞器更新等過程中起著核心作用，對于維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關重要[8]。已有大量研究證實自噬異常與足細胞損傷密切相關。在阿霉素誘導的足細胞損傷模型中，自噬活化可以抑制足細胞的損傷，而在足細胞特異性敲除Atg7的小鼠足細胞損傷加重，該研究結果證實自噬在減輕足細胞損傷中發(fā)揮重要作用[26]，亦有研究在DN中模型中觀察到自噬活性能夠減輕DN尤其足細胞損傷[27]。我們課題組前期在鏈脲佐菌素誘導的DN大鼠模型中發(fā)現(xiàn)足細胞裂孔隔膜蛋白Nephrin與自噬相關蛋白Beclin-1呈正相關，給予活性維生素D3干預后可上調(diào)自噬的表達，同時減輕了足細胞損傷[11]。研究證實，足細胞受損時自發(fā)引起的自噬活化與多種分子機制相關，其中Beclin-1是早期被確定的自噬相關蛋白，目前作為監(jiān)測自噬的標記被廣泛應用，Beclin-1的表達水平在一定程度上代表了自噬活性[28]。細胞內(nèi) LC3-Ⅱ 水平是檢測自噬的另一標志物[29]。當細胞自噬發(fā)生時，P62可與定位在自噬體上的LC3-Ⅱ結合形成復合物，最終在自溶酶體中降解，自噬不足時，P62 降解被抑制，現(xiàn)已用作檢測自噬降低的標志[30]。在本研究中，我們測定了Beclin-1，P62及 LC3-Ⅱ的表達，以確定高糖對足細胞自噬的影響。結果發(fā)現(xiàn)，高糖處理的足細胞中P62表達顯著增多而Beclin-1表達明顯減少，這一結果提示足細胞損傷可激活足細胞自噬，但高糖明顯抑制了其自噬活性，這一結果與上述研究一致。

CBT是一種存在于多種中藥中的天然香豆素類化合物，已被證明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等多種藥理作用[13，15]。本研究在高糖誘導的足細胞損傷的基礎上，探討了CBT對足細胞自噬和腎臟保護的影響及其潛在分子機制，結果發(fā)現(xiàn)CBT對高糖誘導的足細胞損傷具有顯著抑制作用，同時CBT處理后足細胞中Nephrin、Podocin表達顯著升高而Desmin表達下降，表明CBT明顯可抑制足細胞損傷，而P62蛋白表達下降、Beclin-1表達升高，LC3-Ⅱ熒光標記蛋白增多等結果提示CBT可誘導足細胞自噬，保護腎臟受損。

Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR4)屬于受體家族，是參與信號轉導、細胞周期調(diào)節(jié)的參與識別受體[31]。有研究表明，TLR4信號傳導與自噬有關[32]。也有研究表明高糖可激活間質(zhì)細胞中的TLR4，且TLR4在糖尿病患者高糖誘導炎癥反應中起關鍵作用[33]。另外，在胰島β細胞中，可通過調(diào)控脂毒性的TLR-4通路實現(xiàn)拮抗高糖高脂毒性[34]。本研究結果顯示CBT可顯著促進TLR4蛋白表達，同時TLRsiRNA和抑制劑SP600125具有相同的作用結果，即均可下調(diào)Beclin-1、Nephrin、等蛋白表達同時上調(diào)Desmin及P62蛋白表達，表明其可抑制CBT 作用活性，抑制足細胞自噬。JNK是絲裂原活化蛋白激酶的一個重要分支，其在細胞凋亡及臟器細胞受損等過程中起重要作用[35]。本研究結果顯示TLRsiRNA可顯著抑制 p-JNK蛋白表達，提示CBT可通過誘導足細胞自噬對DN的保護作用，而這一過程可能是通過磷酸化JNK信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，CBT可誘導足細胞自噬，抑制足細胞損傷，進而減輕腎臟受損，這一過程可能是通過磷酸化JNK信號通路實現(xiàn)的。我們的研究結果初步為CBT成為治療DN潛在藥物提供了證據(jù)，后續(xù)還需要做更多的研究探索CBT更深層次的作用機制

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