LncRNA HOTAIR、VEGF在腎上腺惡性腫瘤組織中的表達及其預后相關性

杜學謙 孫青風 田龍江

1滄州市人民醫院超聲科，061000；2滄州市人民醫院泌尿外科，061000

腎上腺腫瘤是泌尿外科常見的外科腫瘤，具有良性和惡性之分，惡性腎上腺腫瘤具有遠處轉移、包膜浸潤等特點，患者預后生存率較低，惡性腎上腺腫瘤5年生存率大約為44%。目前研究發現長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)在轉錄、轉錄后等多層次都可對基因表達進行調控，在許多腫瘤中異常表達，與腫瘤的發生、發展及預后具有密切關系[1]。人類同源盒基因(homeobox，HOX)的反義RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)是第一個被發現的LncRNA，與HOXC基因簇共表達，在轉錄后層次調控多種基因的表達。有研究發現HOTAIR在腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中表達水平上調，與腫瘤的良惡性、有無遠處轉移密切相關[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以參與血管生成，與腫瘤轉移也密切相關。關于HOTAIR和VEGF同時在腎上腺腫瘤組織中表達與預后的關系研究較少，因此本研究檢測腎上腺惡性腫瘤組織HOTAIR、VEGF的表達與臨床病理特征及預后的關系，為評估腎上腺腫瘤患者預后提供理論依據。

資料與方法

一、臨床資料

選取2014年1月至2017年1月于滄州市人民醫院手術治療切除的腎上腺標本167例，其中腎上腺惡性腫瘤101例(腎上腺惡性腫瘤組織)，良性腎上腺66例(良性腎上腺組織)。腎上腺惡性腫瘤組織患者，男58例(57.43%)，女43例(42.57%)；年齡范圍40～80歲，年齡(59.96±10.06)歲。良性腎上腺組織患者，男36例(54.55%)，女30例(45.45%)；年齡范圍40～80歲，年齡(60.11±10.16)歲。納入標準：(1)患者術前未進行化療、放療及激素治療；(2)患者臨床資料完整、能夠配合完成隨訪。排除標準：(1)并發其他惡性腫瘤患者；(2)合并自身免疫性疾病者；(3)肝、腎功能嚴重異常的患者。兩組研究對象在性別、年齡上比較差異無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。本研究通過滄州市人民醫院倫理委員會批準(批準號：L102013019)，患者均知情同意。

二、方法

1.評分標準 所有組織均經2位有經驗的醫生進行病理診斷并根據Weiss評分[3]，Weiss評分≥3分診斷為腎上腺惡性腫瘤，Weiss評分<3分診斷為腎上腺良性腫瘤。

2.治療方法 腎上腺腫瘤患者行腹腔鏡手術治療。腎上腺惡性腫瘤患者手術切除腫瘤后一個月，行輔助治療或化療。化療藥物選用密妥坦，使用方法依據臨床常規使用療程。

3.主要試劑及儀器 TRIzol(貨號：15596-026)，武漢科昊佳生物科技有限公司；RNA SYBR Green PCR Kit(貨號：KL101-969)，上海康朗生物科技有限公司；第一鏈cDNA耐熱反轉錄試劑盒(貨號：KL268)，上海康朗生物科技有限公司；CFX96實時熒光定量PCR儀，德國Bio-Rad公司。

4.樣品采集 所有行手術治療切除的腎上腺良、惡性患者入院手術時均留有病理組織(3 cm×3 cm)，組織于液氮中速凍，之后凍存于-80 ℃冰箱中待測。

5.熒光定量PCR檢測組織中HOTAIR、VEGF mRNA的表達 使用TRIzol試劑提取腎上腺惡性腫瘤組織和良性腎上腺組織中總RNA，采用分光光度計檢測RNA純度，挑選RNAOD260/OD280約為1.8～2.0的樣品用于互補DNA反轉錄及實時熒光定量反轉錄PCR(quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR)，依據反轉錄試劑盒操作步驟逆轉錄得到互補DNA，以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參，采用CFX96實時熒光定量PCR儀對HOTAIR、VEGF mRNA及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶進行擴增反應。反應條件：95℃，3 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s；40個循環；72℃，3 min。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設計見表1。反應結束后對所得數據Ct值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算HOTAIR、VEGF mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

三、隨訪

所有腎上腺惡性腫瘤患者術后均接受隨訪，通過電話或復診的方式對所有患者均進行3年隨訪，患者開始治療時即開始隨訪，統計隨訪期間死亡例數及對應死亡時間(本研究中患者死亡皆與本病有關)，本次隨訪截止日期2020年1月。

四、統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對數據進行分析，計數資料用例(%)表示，采用χ2檢驗。本研究數據符合正態分布，計量資料以Mean±SD表示，組間數據符合方差齊性，兩組間比較行獨立樣本t檢驗。Pearson法分析HOTAIR與VEGF的相關性。采用Kaplan-Meier對腎上腺惡性腫瘤患者3年的生存情況進行分析。用COX法分析影響腎上腺惡性腫瘤患者預后的因素。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、腎上腺惡性腫瘤組織和良性腎上腺組織HOTAIR、VEGF mRNA表達水平比較

與良性腎上腺組織相比，腎上腺惡性腫瘤組織HOTAIR、VEGF mRNA相對表達水平較高(P<0.05)。(表2)

表2 腎上腺惡性腫瘤組織和良性腎上腺組織HOTAIR、VEGF mRNA表達水平比較

二、HOTAIR與VEGF相關性分析

Pearson分析顯示，HOTAIR與VEGF呈正相關(r=0.739，P<0.05)。(圖1)

圖1 HOTAIR與VEGF的散點圖

三、HOTAIR、VEGF mRNA表達水平與腎上腺惡性腫瘤患者臨床病理特征的關系

將HOTAIR平均值(4.96)作為分界線，腎上腺腫瘤患者高于4.96分為高表達組共56例，低于4.96為低表達組共45例，將VEGF mRNA平均值(3.54)作為分界線，腎上腺腫瘤患者高于3.54分為高表達組共59例，低于3.54為低表達組共42例。結果顯示HOTAIR、VEGF mRNA與癌細胞發生遠處轉移有關(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤單發或多發無關(P>0.05)。(表3、4)

表3 HOTAIR表達水平與腎上腺腫瘤患者臨床病理特征的關系

表4 VEGF mRNA表達水平與腎上腺腫瘤患者臨床病理特征的關系

四、HOTAIR、VEGF mRNA表達水平與腎上腺惡性腫瘤患者預后的關系

Kaplan-Meier法顯示HOTAIR低表達腎上腺惡性腫瘤患者的生存時間為(32.09±0.92)個月，顯著長于HOTAIR高表達腎上腺惡性腫瘤患者(21.64±1.49)個月，Log Rank檢驗，χ2=20.916，P<0.01(圖2)。VEGF mRNA低表達腎上腺惡性腫瘤患者的生存時間為(31.81±0.97)個月，顯著長于VEGF mRNA高表達腎上腺惡性腫瘤患者(22.37±1.47)個月，Log Rank檢驗，χ2=14.849，P<0.01。(圖3)

圖2 HOTAIR表達水平與腎上腺惡性腫瘤患者預后的函數

圖3 VEGF mRNA表達水平與腎上腺惡性腫瘤患者預后的函數

五、影響腎上腺惡性腫瘤患者預后的危險因素分析

單因素分析表明，癌細胞有無遠處轉移、HOTAIR高表達、VEGF高表達均是影響腎上腺惡性腫瘤患者不良預后的危險因素。多因素分析表明，癌細胞遠處轉移、HOTAIR高表達、VEGF高表達是影響腎上腺惡性腫瘤患者不良預后的獨立危險因素(P均<0.05)。(表5、6)

表5 腎上腺腫瘤患者臨床資料的變量賦值

討 論

LncRNA是一類長度超過200 nt的單鏈RNA，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物。近年來發現LncRNA是在腫瘤中具有特異性表達，可參與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移等，從而調控腫瘤的發生、發展[4-5]。HOTAIR位于人體第12號染色體HOXC簇中HOXC11和HOXC12之間的基因間區域[6]。文獻報告HOTAIR可通過多種方式參與細胞基質的調節，例如沉默基因表達、結合染色質修飾酶等[7]。有文獻報告HOTAIR在上皮癌細胞中過表達可使哺乳動物多梳蛋白抑制復合體2(PRC2)相關基因在細胞內重新定位，促使細胞發揮胚胎纖維細胞的類似的功能，抑制H3組蛋白第27位賴氨酸(H3K27)發生甲基化，進而提高腫瘤細胞侵襲和轉移能力[8]。王慧霄等[9]文獻報告HOTAIR可聚集PRC2促使H3K27發生甲基化，另外HOTAIR 5′端可與PRC2結合，然后介導PRC2沉默相關抑癌基因的轉錄，進而導致乳腺癌的復發及癌細胞轉移。葉嶺等[10]研究發現HOTAIR在宮頸癌組織中表達水平明顯高于正常宮頸上皮細胞，HOTAIR高表達可能對宮頸癌細胞生長、遷移具有促進作用。劉泓鍵等[11]研究發現HOTAIR 在膀胱癌細胞表達水平呈上調，沉默HOTAIR表達可抑制膀胱癌細胞增殖并促進其凋亡，猜測HOTAIR可能通過調控Notch信號通路發揮對腫瘤細胞的調控作用。本研究發現腎上腺惡性腫瘤組織HOTAIR相對表達水平顯著高于良性腎上腺組織，臨床病理特征分析HOTAIR與腫瘤直徑、腫瘤良性或惡性、有無遠處轉移相關，提示HOTAIR可能影響腎上腺惡性腫瘤的發生、發展，相關文獻報道提示HOTAIR可能通過調控相關抑癌基因的轉錄，從而影響腫瘤的增殖、遷移等[10-11]。

表6 影響腎上腺惡性腫瘤患者預后的危險因素分析

VEGF是血管生成的重要調控因子，能直接誘導血管內皮細胞增殖和血管腔形成。近年來有很多文獻報告VEGF與腫瘤的發生、癌細胞浸潤及轉移有密切關系，其作用機制是通過促進腫瘤血管生成，增加血管壁的滲透性，從而促進腫瘤細胞的增殖[12-13]。蔣艷霞等[14]研究發現VEGF在腎細胞癌組織中表達水平明顯高于正常腎組織，與腎細胞癌組織腫瘤大小、TNM分期、浸潤性生長和轉移具有顯著相關。徐海波等[15]研究發現VEGF在膀胱癌組織表達水平明顯高于正常癌旁組織，與膀胱癌病理分期、病理分級、癌細胞生長、遷移密切相關。王亞奇等[16]研究發現VEGF在人腎上腺腫瘤組織中表達水平高于正常腎上腺組織，可能與腎上腺腫瘤微血管形成及腫瘤細胞生長有關。本研究發現腎上腺惡性腫瘤組織VEGF mRNA相對表達水平顯著高于良性腎上腺組織，臨床病理特征分析VEGF與有無遠處轉移相關，提示VEGF可能參與腎上腺腫瘤的發生、發展，猜測VEGF可能通過調控血管生成從而影響腫瘤細胞的增殖、遷移等。Zhao等[17]在研究HOTAIR表達水平與膠質瘤侵襲性的關系中發現，HOTAIR表達水平與VEGF呈正相關。高建芝等[18]證實HOTAIR通過靶向VEGF/VEGFR信號通路，在肝癌細胞的侵襲和轉移中發揮作用。本研究發現HOTAIR與VEGF具有正相關性，提示HOTAIR可能與VEGF共同發揮作用，調控腎上腺腫瘤發生及腫瘤患者不良預后。單因素分析顯示HOTAIR低表達腎上腺腫瘤患者生存時間顯著長于HOTAIR高表達腎上腺惡性腫瘤患者，VEGF mRNA低表達腎上腺惡性腫瘤患者生存時間顯著長于VEGF mRNA高表達患者，多因素分析表明，遠處轉移、HOTAIR高表達、VEGF高表達是影響腎上腺惡性腫瘤患者不良預后的獨立危險因素，提示HOTAIR高表達、VEGF高表達患者可能預示腎上腺惡性腫瘤患者易發生不良預后。

綜上所述，本研究發現HOTAIR、VEGF與腎上腺惡性腫瘤的病情進展及預后具有相關性，HOTAIR、VEGF的表達水平與腎上腺惡性腫瘤患者有無遠處轉移具有密切關系，是否能成為腎上腺腫瘤治療的靶位點，還需進一步深入研究HOTAIR、VEGF對腎上腺腫瘤的調控機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突