基于銀納米粒子-CdTe量子點復合物熒光探針檢測水樣和血清中L-半胱氨酸

占 鑫, 王秋月, 吳一微*

(污染物分析與資源化技術湖北省重點實驗室,湖北師范大學化學化工學院,湖北黃石 435002)

L-半胱氨酸(L-Cys)作為小分子生物硫醇氨基酸,其作用是維持細胞或有機體中蛋白質的氧化還原狀態。L-Cys水平的改變與肝損傷、皮膚損傷、帕金森等疾病[1]密切相關。因此,建立一種簡單、靈敏、高選擇性的新方法快速檢測血清中L-Cys至關重要。

熒光光譜法[2]是檢測L-Cys最常用的手段,具有選擇性好、靈敏度高且測量方便的優點。但傳統的有機熒光探針(羅丹明B)具有光譜帶相對較寬,且不對稱[3]等不足,限制了方法的選擇性和靈敏度。為了獲得穩定、高選擇性的納米復合物熒光探針,常采用硫醇分子或大分子作為封蓋劑,形成保護層,從而避免量子點聚合猝滅,但這增加了量子點與猝滅劑/受體之間的距離,從而削弱了響應靈敏度[4]。為了解決這些問題,可以通過內濾效應(IFE)機制來設計基于納米顆粒激活量子點熒光的復合物探針,這種機制不需要分子間相互作用，以及調整熒光團與猝滅物或受體之間的距離[5]。因此，開發基于IFE機制的新型量子點復合物探針檢測L-Cys必不可少。

在本課題組前期工作中,開發了一種采用巰基乙酸(TGA)修飾的CdTe QDs作為熒光團,直接與銀納米粒子(AgNPs)復合的AgNPs/CdTe QDs探針用于特異性識別與檢測H2S[6]。本文采用TGA修飾的CdTe QDs作為熒光團,與CQDs-AgNPs通過S-Ag鍵的結合,引發熒光猝滅效應,形成弱熒光的CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針,在加入L-Cys后,激發體系熒光恢復,據此建立靈敏的特異性檢測血清和環境水樣中L-Cys的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

LS45熒光光譜儀(美國，Perkin Elmer);U-3010分光光度計(日本，Hitachi);5700紅外光譜儀(美國，Nicolet);PB-10 pH計(德國，Sartorius);90+/BI-MAS(美國，布魯克黑文);Zeta-asizer(英國，Nano-Z,Malvern);X-ray diffraction(D/max-rC旋轉陽極,Rigaku);JEM-2100透射電鏡(日本，JEOL);FLS 980時間分辨分光鏡(英國，愛丁堡)。

Cd(CH3COO)2·H2O,巰基乙酸(TGA),K2TeO3(上海化學試劑公司);L-半胱氨酸(L-Cys)(Aladdin);H3BO3(武漢江北試劑廠);H3PO4(開封東大化工有限公司);水為超純水。

1.2 CQDs-AgNPs復合材料的合成

CQDs的合成[6]:將0.72 g葡萄糖溶于25 mL超純水中,超聲10 min后,轉入50 mL圓底燒瓶,置入200 ℃真空干燥箱中密封反應2 h,得到淡黃色透明粘稠液體,自然冷卻至室溫,加入25 mL超純水超聲溶解后,4 ℃密封保存。

CQDs-AgNPs的合成[6]:分別將2 mL 10 mmol/L的AgNO3溶液,2 mL CQDs,4 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,13.8 mL超純水加入至三頸圓底燒瓶中,50 ℃、1 200 r/min磁力攪拌,避光反應30 min,制得亮黃色CQDs-AgNPs復合材料,4 ℃密封保存。

1.3 CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針的制備

CdTe QDs的合成[7]：將7.0 μmol/L CdTe QDs及200 μL CQDs-AgNPs混合，并溶解于625 μL 10 mmol/L的B-R緩沖溶液(pH=7.0)中,置于冰水中10 min后，4 ℃密封保存。

1.4 CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針用于L-Cys的檢測

將上述制得的納米復合物探針分別和不同濃度的L-Cys混合,再分別用10 mmol/L的B-R緩沖液(pH=7.0)定容至5.0 mL,反應12 min,用熒光分光光度計分別測定溶液在λem=555 nm處的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 CdTe QDs的表征

CdTe QDs(λex/λem=458/555 nm) 溶液在365 nm紫外燈下可見黃綠色熒光(圖1a);CdTe QDs的X射線衍射(XRD)峰位置與體積立方CdTe(blende鋅)接近(圖1b);CdTeQDs的透射電鏡(TEM)(圖1c)表明其粒徑為2.4 nm;圖1d是TGA和TGA-CdTe QDs的傅立葉紅外(FT-IR)光譜圖,可見O-H(3 440 cm-1),C=O(1 710 cm-1)特征峰移至短波長區間,S-H(2 600～2 500 cm-1)特征峰消失,表明TGA通過S-Cd鍵已成功修飾到CdTe QDs表面。

圖1 CdTe QDs的表征：(a) CdTe QDs的激發和發射光譜;(b) CdTe QDs的X射線衍射圖;(c) CdTe QDs的透射電鏡圖;(d)TGA和TGA-CdTe QDs的FT-IR光譜圖Fig.1 Characterization of CdTe QDs:(a) Fluorescence excitation and emission spectra of CdTe QDs;(b) Powder XRD patterns of CdTe QDs;(c) TEM image of CdTe QDs;(d) FT-IR spectra of TGA and TGA-CdTe QDs

2.2 CQDs-AgNPs的表征

圖2a紫外-可見吸收圖譜表明CQDs-AgNPs復合物在波長396 nm處有一單吸收峰,且從紅外光譜圖(圖2b)中可知，CQDs的紅外光譜少了一個C-O-C吸收振動峰。

圖2 (a)CQDs-AgNPs的紫外-可見光譜圖;(b)CQD和CQD-AgNPs的和紅外光譜圖Fig.2 (a)UV-Vis spectrum of CQDs-AgNPs;(b)Infrared spectra of CQD and CQDs-AgNPs

2.3 CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針的組裝條件優化

圖3 CQDs-AgNPs/CdTe QDs納米復合物探針的選擇性Fig.3 Selectivity of CQDs-AgNPs/CdTe QDs probe

為使納米復合物探針的組裝過程達到最佳效果,優化了引起CdTe QDs猝滅的CQDs-AgNPs的體積及猝滅時間。結果表明,當CQDs-AgNPs的體積為200 μL時,CdTe QDs的熒光猝滅程度最大(猝滅效率為76%),且在10 min完成。因此,加入CQDs-AgNPs的最優體積為200 μL,最佳猝滅時間為10 min。

2.4 CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針的選擇性

鑒于血清的基體復雜,分別考察了L-Cys、金屬陽離子，抗壞血酸(AA)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Try)、胱氨酸(Cys-Cys)、甘氨酸(Gly)、葡萄糖(Glu)與復物探針反應12 min后發射波長555 nm處的熒光強度。結果如圖3所示,只有L-Cys較大程度地恢復了該復合物探針的熒光,表明其對L-Cys具有較好的選擇性。

2.5 L-Cys對CQDs-AgNPs/CdTe QDs納米復合物探針的熒光恢復響應時間及體系pH優化

實驗探究了L-Cys對復合物探針在B-R緩沖液(pH=7.0)中的熒光恢復響應時間。結果表明,該探針在加入30 μmol/L L-Cys后,發射波長555 nm處熒光強度隨著時間(0～12 min)的增加逐漸激活并恢復,在12 min時熒光恢復程度達到最大,并在12～16 min處形成一個穩定的平臺。實驗還分別探究了不同pH值對該探針熒光強度的影響,以及在L-Cys存在下,不同pH值對其熒光強度恢復的影響。結果表明,在pH=7.0時能最大程度地恢復納米復合物探針的熒光強度。綜上,選擇熒光恢復最佳時間和pH分別為12 min和7.0。

2.6 分析性能

在最佳條件下,探究了CQDs-AgNPs/CdTe QDs與不同濃度L-Cys(0～40 μmol/L)反應12 min后熒光強度的變化。結果表明,復合物探針在發射波長555 nm處的熒光強度隨著L-Cys濃度的增大不斷增加,在濃度30 μmol/L時增加到最大,然后在30～40 μmol/L之后形成一個平臺;在0.1～30 μmol/L的濃度范圍內,熒光恢復程度與強度呈良好的線性：F/F0=0.075c+1.11(R2=0.9923),F0和F分別表示L-Cys加入前后熒光強度),檢測限為32 nmol/L,相對標準偏差為2.6%。同時,與其他檢測L-Cys方法[8-10]相比,本方法具有簡單、靈敏、選擇性好的優點。由于使熒光探針猝滅的因素太多，最關鍵的是此法能采用熒光恢復的方式檢測L-Cys,大大降低了假陽性率。

2.7 CQDs-AgNPs/CdTe QDs納米復合物探針對L-Cys的檢測機理探究

如圖4所示,CQDs-AgNPs中Ag+與CdTe QDs表面的S2-通過S-Ag結合,使CdTe QDs的表面形成缺陷,導致CdTe QDs熒光有很大程度地猝滅,形成弱熒光的CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針。隨著L-Cys的加入,由于L-Cys中-S-與復合物探針中Ag+競爭絡合,導致CdTe QDs輻射中心減少,同時活化了CdTe QDs的表面缺陷[11],使得CdTe QDs熒光得到恢復,從而實現對L-Cys的高靈敏、高選擇性的檢測。

圖4 可激活CQDs-AgNPs/CdTe QDs納米復合物探針檢測L-Cys的機理圖Fig.4 Mechanism of CQDs-AgNPs/CdTe QDs probe towards L-Cys

2.8 實際樣品的檢測

經過0.45 μm濾膜過濾的的水樣來自黃石市青山湖,血清樣品來自黃石第二醫院檢驗科。在最佳條件下,采用CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針檢測水樣和血清中的L-Cys,并測試加標回收情況,以進一步驗證方法的應用性能。結果如表1所示,該方法對L-Cys的回收率為97.4%～116.0%,相對標準差(RSD)小于3.0%,有較好的精密度和準確度,為臨床研究測試血清中L-Cys提供新方法。

表1 血清中L-Cys的檢測結果(n=3)

3 結論

本文通過碳量子點原位還原制備了以CQDs-AgNPs作為猝滅劑,巰基乙酸修飾的CdTe QDs作為熒光團,弱熒光的CQDs-AgNPs/CdTe QDs復合物探針。由于L-Cys中-S-與復合物探針中Ag+競爭絡合作用,在L-Cys的激活下,CdTe QDs的熒光得到恢復,據此實現對水樣和血清中L-Cys的準確檢測。與傳統熒光猝滅檢測方法相比,本法采用熒光恢復的方式達到檢測目的,這樣假陽性率就大大降低,為醫學分析提供了新的檢測技術。