超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定沼液中的林可霉素和大環(huán)內酯類抗生素

仲伶俐， 鄭幸果， 趙 珊， 雷欣宇， 黃世群， 秦 琳， 郭靈安， 李 曦

(四川省農業(yè)科學院分析測試中心，四川成都 610066)

沼液是人、畜禽糞污以及秸稈等有機物在沼氣池中，經過充分無氧發(fā)酵產生沼氣后的殘留液體，含有植物生長所需的多種水溶性養(yǎng)分，氮、磷、鉀等常量元素和多種微量元素，以及腐殖質、水解酶和氨基酸等多種活性物質[1]。作為優(yōu)質的有機肥料，沼液的施用也符合我國農業(yè)部提出的“雙減行動”及“一控兩減三基本”的政策要求[2]。但隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用，動物體內不能完全代謝降解的獸藥抗生素隨畜禽糞便和尿液排出，進而通過有機肥料的施用進入農田土壤,將導致環(huán)境抗生素殘留以及耐藥細菌的傳播擴散，對生態(tài)環(huán)境和人體健康存在潛在危害性[3,4]。抗生素污染已經引起國內外環(huán)境領域學者的重視，我國部分地區(qū)已開展了對施肥土壤的抗生素污染調查[5]，也有研究者在水、土壤、污泥等多種環(huán)境中檢出了抗生素類藥物殘留[6]。

大環(huán)內酯類藥物(Macrolide Drugs，MALs)是一類廣譜抗生素獸藥，在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛用于防治呼吸道、胃腸道感染等疾病，同時也可作生長促進劑[7-9]。國內外關于大環(huán)內酯類抗生素的研究所涉及的基質較為廣泛，有動物肌肉[7,8]、奶[9]、蜂蜜[10]、土壤[4,11]、糞便[3,4,11,12]、污泥[6]、水產養(yǎng)殖環(huán)境沉積物[13]、水[4,14,15]等。所用檢測儀器普遍為液相色譜-串聯(lián)質譜儀(LC-MS/MS)，前處理技術多采用固相萃取法[3,4,6-8,14-16]、基質固相分散法[9]、QuEChERS法[13]。目前國內對沼液中抗生素藥物的研究甚少，抗生素種類也主要涉及喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類和β-受體激動劑類。王光杰等建立了豬糞便、尿液和沼液中磺胺類、喹諾酮類和紅霉素的LC-MS/MS檢測方法[16]；賀南南等分析了南京市以豬、牛、雞糞發(fā)酵的沼液樣品，用高效液相色譜-熒光檢測法檢測出4種喹諾酮類藥物[17]，并用高效液相色譜-紫外檢測法測定了沼液中3種四環(huán)素類和6種磺胺類抗生素，最終檢測出磺胺嘧啶和磺胺甲惡唑[18]；楊挺等建立了沼液中9種β-受體激動劑的檢測方法并對樣品進行了測定[19]。因此，有必要建立沼液中大環(huán)內酯類抗生素的快速分析方法，以了解沼液中大環(huán)內酯類抗生素的殘留水平和污染狀況，為進一步監(jiān)測其在環(huán)境中的傳播情況提供技術基礎。

本研究建立了反相固相萃取凈化結合LC-MS/MS測定沼液中林可霉素和6種大環(huán)內酯類抗生素的方法，該方法省去了固相萃取凈化后的常規(guī)濃縮操作步驟，在準確的同時，操作更加簡單、快速，同時節(jié)約成本。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC/MS-8040超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(日本，島津公司)；N-EVAP-112氮吹濃縮儀(美國，Organomation Associates,Inc.公司)；TG -16臺式高速離心機；WH-3微型渦旋混合儀；DT-1002A電子天平。Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3mL，美國Waters公司)；Bond Elut C18 固相萃取小柱(100 mg/1mL ，美國Agilent公司)。

7種抗生素標準品：林可霉素(Lincomycin，純度99.6%)、螺旋霉素(Spiramycin，純度95.0%)、替米考星(Tilmicosin，純度80.7%)、泰樂菌素(Tylosin，純度94.1%)、紅霉素(Erythromycin，純度95.0%)、羅紅霉素(Roxithromycin，純度96.2%)，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；交沙霉素(Josamycin，純度91.2%)購自曼哈格生物科技有限公司。甲酸(色譜純，上海安譜)，甲酸銨(色譜-質譜級，上海安譜)；甲醇(色譜純，美國fisher公司)、乙腈(色譜純，美國fisher公司)。實驗用水均為優(yōu)普超純水系統(tǒng)制備。

1.2 溶液配制

分別準確稱取適量林可霉素、替米考星、泰樂菌素、紅霉素、螺旋霉素、交沙霉素和羅紅霉素標準品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為200 μg/mL的單標標準儲備溶液，貯存于密閉的棕色玻璃瓶中。分別準確吸取各單標標準儲備溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成質量濃度為10.0 μg/mL的混合標準儲備溶液。吸取混合標準儲備溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成質量濃度為1.0 μg/mL的混合標準工作溶液，于4 ℃下避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品采集與預處理沼液樣品采自四川省不同縣郊養(yǎng)豬場，多點收集沼液并混合均勻成為一個沼液樣品，避光密封，帶回實驗室在室溫條件下保存。

1.3.2 固相萃取凈化Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3mL)凈化：取10 mL搖勻的沼液于15 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min。吸取5 mL上清液過Oasis HLB固相萃取小柱(使用前用5 mL甲醇和5 mL 水預處理)，待樣液完全流出后，用10%甲醇水溶液5 mL淋洗，棄去全部流出液，減壓抽干小柱，最后用10 mL甲醇洗脫，將洗脫液氮吹濃縮至干，用2 mL甲醇-水溶液(1∶1，V/V)溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS法測定。C18固相萃取柱(100 mg/1mL)凈化：取10 mL搖勻的沼液于15 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min。吸取2 mL上清液過C18 固相萃取小柱(使用前用2 mL甲醇和2 mL水預處理)，待樣液完全流出后，用5%甲醇水溶液2mL淋洗，棄去全部流出液，減壓抽干小柱，最后用1 mL甲醇洗脫，將洗脫液渦旋混勻，取0.5 mL洗脫液加入0.5 mL水混勻，過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS法測定。

1.4 儀器測定方法

1.4.1 色譜條件色譜柱:Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相:A為乙腈，B為含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液；梯度洗脫：0～1.0 min，88%～70%B；1.0～3.0 mim，70%～45%B；3.0～5.0 min，45%～30%B；5.0～5.01 min，30%～88%B；5.01～6.5 min，88%B。流速：0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

1.4.2 質譜條件電噴霧電離，正離子模式(ESI+)；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)；霧化氣流速：3 L/min；DL溫度：300 ℃；加熱模塊溫度：500 ℃；干燥氣流速：20 L/min。7種抗生素的MRM參數(shù)見表1。

表1 7種抗生素的MRM質譜參數(shù)

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

通過全掃描發(fā)現(xiàn)7種化合物均能在ESI+下生成較強的[M+H]+準分子離子峰，通過子離子掃描，優(yōu)化得到各質譜參數(shù)(表1)。7種大環(huán)內酯類抗生素在C18色譜柱上均有較好的保留，實驗選擇兼具高分離能力和高耐壓性的ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。由于7種化合物極性大小的差異，采用梯度洗脫以縮短分析時間，提高靈敏度。實驗比較了7種化合物在乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液等不同流動相條件下的響應強度。結果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水為流動相時替米考星和螺旋霉素峰形不好，林可霉素響應值較低；以乙腈-0.01%甲酸水溶液為流動相時替米考星和螺旋霉素的峰形和響應值都得到明顯改善，林可霉素的峰響應也顯著增強。說明一定的酸性條件能夠促進替米考星、螺旋霉素和林可霉素的電離；繼續(xù)增加流動相中甲酸的含量至0.1%，替米考星和螺旋霉素的峰響應值也稍有增強；當0.1%甲酸水溶液中加入5 mmol/L 甲酸銨時，替米考星和螺旋霉素峰響應略微下降，但流動相中鹽的加入使各化合物的保留都有所增強，更有利于混合物的分離。因此，確定以乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液為流動相，梯度洗脫。從7種抗生素在沼液加標樣品的提取離子色譜圖如圖1所示。

圖1 7種抗生素在沼液加標樣品的提取離子色譜圖(1.0 ng/mL)Fig.1 Extracted ion chromatograms of 7 antibiotics spiked in biogas slurry(1.0 ng/mL)

2.2 固相萃取方法的選擇和優(yōu)化

圖2 不同固相萃取小柱對7種抗生素回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of different SPE columns on recoveries of 7 antibiotics(n=3)

水體中涉及大環(huán)內酯類抗生素的檢測基本采用HLB固相萃取柱凈化，如郭欣妍等建立了水中林可霉素和4種大環(huán)內酯類等多種抗生素的方法[4]；徐潔等測定了水中5種大環(huán)內酯類抗生素[14]；唐才明等建立了水體中含3種大環(huán)內酯類抗生素的分析方法[15]。本文比較了Oasis HLB小柱(60 mg/3mL)和C18小柱(100 mg/1mL)對7種抗生素平均回收率的影響(圖2)。采用Oasis HLB小柱(60 mg/3mL)凈化時，螺旋霉素和替米考星回收率偏低，若要獲得滿意的回收率需將甲醇洗脫體積增加至10 mL以上，不利于快速分析。而采用Bond Elut C18小柱(100 mg/1mL)凈化時，7種抗生素回收率均達到80%以上。本文選擇Bond Elut C18小柱(100 mg/1mL)凈化。此外，為了簡化實驗步驟，采用C18小柱凈化時，將收集的1 mL甲醇洗脫液混勻后，取0.5 mL與0.5 mL水混勻、過濾即可用于測定，而無需將洗脫液濃縮后再復溶，相比文獻報道方法更加簡單、快速，大大節(jié)約了分析時間，提高了分析效率。使用此凈化方法在選定的儀器條件下測定，樣品基質對目標化合物的定性和定量分析基本無干擾。

2.3 基質效應

參照文獻方法[7]，以空白基質(沼液)中標準物質峰面積(A)和甲醇-水溶液(1∶1，V/V)中標準物質峰面積(B)的比值考察基質效應(ME)：ME=A/B×100%，ME<1為基質抑制作用；ME>1為基質增強效應；ME=1則基本無基質效應。結果發(fā)現(xiàn)，7種抗生素在沼液基質中的基質效應為0.98～1.47。其中，螺旋霉素和替米考星ME>1.2，其余5種抗生素為0.98

2.4 方法的線性范圍、檢測限和定量限

吸取適量混合標準工作溶液，用空白樣品溶液稀釋成質量濃度為0.2、1.0、5.0、50.0、200.0 ng/mL的系列混合基質標準溶液，注入UPLC-MS/MS儀測定，以質量濃度(x)為橫坐標、定量離子的峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線。分別以信噪比大于等于3和信噪比大于等于10對應的加標濃度作為方法檢測限和定量限。結果表明，7種抗生素在0.2～200.0 ng/mL范圍內線性關系良好(r>0.997)，檢測限為0.1～0.5 ng/mL，定量限為0.2～1.0 ng/mL，結果見表2。

表2 7種抗生素的回歸方程、相關系數(shù)(r)、檢測限(LODs)和定量限(LOQs)

2.5 方法回收率與精密度

在空白樣品中添加不同濃度水平的混合標準工作溶液，每個添加濃度設置6個平行，同時作空白對照，按“1.3”方法前處理，按“1.4”儀器條件進行測定，計算平均回收率及相對標準偏差(RSD)。由表3可知，螺旋霉素、替米考星在1.0、5.0和50.0 ng/mL添加濃度下，回收率為76.6%～94.1%，RSD為3.5%～12.7%；林可霉素、泰樂菌素、紅霉素、交沙霉素和羅紅霉素在0.2、1.0、5.0和50.0 ng/mL添加濃度下，回收率為72.5%～100.1%，RSD為2.3%～11.1%。說明該方法準確度較高、重現(xiàn)性較好，適用于沼液中這7種抗生素的測定。

表3 7種抗生素在沼液中的加標回收率和RSDs結果(n=6)

2.6 實際樣品測定

利用該方法對四川省不同縣郊養(yǎng)豬場的10個沼液樣品中林可霉素和6種大環(huán)內酯類化合物進行測定，結果檢出林可霉素和替米考星2種藥物，螺旋霉素、泰樂菌素、紅霉素、交沙霉素和羅紅霉素在所有樣品中均未檢出。其中，林可霉素在10個沼液樣品中均有檢出，濃度在0.20～75.6 ng/mL范圍，6個沼液樣品中檢出替米考星，濃度在0.32～16.8 ng/mL。沼液樣品的提取離子色譜圖見圖3。

圖3 沼液樣品中林可霉素和替米考星的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of lincomycin and tilmicosin in biogas slurry

3 結論

通過優(yōu)化色譜、質譜條件和固相萃取凈化方法，建立了沼液中林可霉素和6種大環(huán)內酯類抗生素的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法，并進行了方法驗證。該方法在固相萃取凈化后不需要經過氮吹或旋轉蒸發(fā)濃縮步驟，準確的同時，更加簡單、快速，且節(jié)約成本。利用該方法對沼液中林可霉素和大環(huán)內酯類抗生素進行分析，掌握沼液中此類抗生素的殘留水平和污染狀況，為進一步監(jiān)測其在環(huán)境中的傳播情況打下基礎。