高效液相色譜法測定小鼠肝臟中的兩種苯并三唑類紫外線吸收劑

朱梅青， 崔 蓉*

(北京大學公共衛生學院，北京 100191)

2-(2′-羥基-3′,5′-二叔丁基苯基)-5-氯苯并三唑(2,4-Di-tert-butyl-6-(5-chloro-2H-benzotriazole-2-yl)phenol，UV-327)、2-(2′-羥基-3′,5′-二叔戊基苯基)-苯并三唑(2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol，UV-328)均為苯并三唑類紫外線吸收劑，它們能強烈吸收270～380 nm和290～400 nm的紫外光[1]。因化學性質穩定，揮發性小，與聚烯烴相容性好而廣泛應用于油漆涂料、合成纖維、毛紡織品、感光材料、食品包裝材料和化妝品中。UV-327和UV-328在環境中不易降解、高度親脂，易在體內蓄積，且具有潛在毒性，已成為備受關注的一類新型環境內分泌干擾物[2]。暴露于特定的職業環境、水環境污染以及食品包裝材料的遷移等都有可能使人體接觸到此類物質。研究表明，淺水魚類(鯔魚、鱸魚)肝臟中UV-327的濃度比其他部位高3～4倍，與烏魚肝臟中UV-328的濃度分布一致，表明該類化合物可能優先積累在某些魚種的肝臟，且降解較少[3]。多項大鼠實驗結果表明，UV-327和UV-328對肝臟有明顯的毒性作用。每日用摻入UV-328(>200 μg/g)的飼料喂養大鼠90 d，可觀察到大鼠的血液、肝臟和腎臟均產生不良影響[4]。以UV-327(22～800 mg/kg/d)喂養大鼠90 d[5]，大鼠肝臟重量呈劑量依賴性增加，出現肝臟毒性癥狀，且雄性大鼠在25 mg/kg UV-327重復劑量暴露下，其血清中堿性磷酸酶、白蛋白和白/球蛋白比值、絕對肝臟重量和相對肝臟重量均升高[6]。由此可見，肝臟是UV-327和UV-328毒性效應的重要靶器官。

目前，有關UV-327和UV-328測定方法的研究仍多集中于非生物樣品的檢測，如污水[7]、污泥[8]和塑料食品包裝材料[9]等，而生物樣品中檢測方法的報道較少，且目前尚未見小鼠組織中UV-327和UV-328測定方法的研究報道。本研究建立了小鼠肝臟中UV-327與UV-328的測定方法，可為后續進一步研究其在動物體內的代謝過程、組織中的分布特征以及動態變化規律等提供檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Waters高效液相色譜儀(美國，Waters科技有限公司)，包括Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 717 plus Autosampler，Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；MX-S旋渦混合儀(美國，Scilogex公司)；TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)；D -130手持式超細勻漿器(德國，Wiggens公司)。

UV-320(2-(2′-羥基-3′,5′-二叔丁基苯基)-苯并三唑，內標)，純度98%(上海畢得醫藥科技有限公司)；UV-327、UV-328，純度98%(薩恩化學技術(上海)有限公司)；甲醇(純度≥99.9%)；丙酮；正己烷；生理鹽水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制分別稱取10 mg UV-320、UV-327及UV-328，于100 mL容量瓶中用甲醇定容，配制成質量濃度均為100 μg/mL的標準儲備液。取一定體積UV-320標準儲備液，用甲醇逐級稀釋配制質量濃度為0.40 μg/mL的UV-320標準應用液。取一定體積UV-327及UV-328標準儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制質量濃度分別為0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、10.0、20.0、40.0 μg/mL的UV-327和UV-328混合標準系列溶液。

1.2.2 樣品采集與預處理小鼠脫臼處死，在冰面上迅速取出肝臟，用生理鹽水洗凈表面的血液，濾紙吸干后稱重。按照0.50 g/mL(小鼠肝臟重量/生理鹽水體積)加入生理鹽水，渦旋混勻。取100 μL小鼠肝臟勻漿，加入1.0 mL正己烷-丙酮溶液(體積比1∶1)，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min。將上清液轉入干凈管中，50 ℃氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇溶解，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min，上清液經0.45 μm尼龍過濾器過濾，高效液相色譜-紫外檢測器測定。

1.2.3 色譜條件色譜柱：Waters SymmetryC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；保護柱：Waters SymmetryC18柱(20 mm×3.9 mm，5 μm)；流動相：甲醇；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：340 nm；柱溫：24 ℃；進樣量：10 μL。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 測定波長的選擇依據文獻報道[1]可知，UV-320、UV-327和UV-328在紫外-可見波長范圍內均有2個吸收峰，其波長分別為303、340 nm(UV-320)，313、345 nm(UV-327)和299、336 nm(UV-328)，且各組分的后一個吸收峰的吸收強度較大，因此，檢測波長選擇340 nm。

2.1.2 色譜條件的選擇本實驗分別以甲醇、乙腈、甲醇+水、甲醇+20%乙腈水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、95%甲醇-乙腈溶液+水、甲醇+0.1%甲酸作為流動相，考察各組分的分離情況。結果發現，以甲醇為流動相時，基線穩定，各組分分離良好，且肝臟內源性物質不干擾組分和內標的測定。因此，本實驗最終確定以甲醇為流動相，流速1.0 mL/min。

2.1.3 樣品前處理方法的選擇既往文獻報道中，測定生物樣品中UV-327和UV-328含量時，通常采用超聲法[4]、索氏提取法[2]或萃取法[10]提取目標物，萃取液經凝膠滲透色譜法去除脂質，硅膠柱層析法去除非極性雜質等，操作步驟繁雜，耗時較長。常用的萃取劑為甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、甲苯、氯仿以及二氯甲烷/乙醚或其混合溶液[11]。本實驗對比了甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、正己烷-丙酮作為提取劑的實驗結果，發現以1.0 mL正己烷-丙酮混合液(體積比1∶1)作為萃取液，UV-327和UV-328的萃取效率較高，萃取效果好，且方法簡便快速。

2.2 特異性

在上述已確定的色譜條件下，考察內源性物質對目標物質測定的影響。如圖1所示，UV-327、UV-328與內標UV-320的色譜峰峰形良好，可完全分離，且肝臟中內源性物質對UV-327、UV-328與內標UV-320的測定無干擾。

圖1 小鼠肝中UV-320、UV-327和UV-328的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of UV-320,UV-327 and UV-328 in mice livera.blank liver;b.blank liver spiked with UV-320(0.20μg/mL);c.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL) and UV-327(2.00 μg/mL);d.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL) and UV-328(2.00 μg/mL);e.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL),UV-327(2.00 μg/mL) and UV-328(2.00 μg/mL).

2.3 工作曲線的線性范圍、檢出限與定量限

取空白小鼠肝臟勻漿100 μL，分別加入0.40 μg/mL UV-320溶液100 μL，不同濃度UV-327和UV-328混合標準溶液100 μL，按照“1.2.2”所述方法處理樣品。以UV-327或UV-328的質量濃度為橫坐標，UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比值為縱坐標，繪制工作曲線。分別以3倍和10倍噪聲水平對應的UV-327或UV-328的濃度確定方法的檢出限和定量限。結果顯示，在實驗選定的色譜條件下，在0.05～20.0 μg/mL濃度范圍內，UV-327或UV-328與內標UV-320(0.20 μg/mL)的峰面積比值呈現良好的線性關系，回歸方程分別為：y=4.6242x-0.011，r=0.9999；y=4.2498x-0.3582，r=0.9998。UV-327和UV-328的檢出限均為0.01 μg/mL，定量限均為0.03 μg/mL。

2.4 準確度與精密度

取空白小鼠肝臟勻漿100 μL，加入0.40 μg/mL UV-320溶液，以及一定濃度的 UV-327和UV-328混合標準溶液各100 μL，制備低、中、高(0.20、2.00、16.0 μg/mL)3種加標濃度的質控樣品，每種濃度做6個平行樣，連續測定3 d，考察方法的準確度和精密度。3種加標濃度的質控樣品中UV-327和UV-328的平均回收率分別為97.2%、94.9%、98.5%與102.2%、97.0%、99.1%；日內精密度分別為5.6%、4.9%、3.7%與5.3%、4.5%、3.8%；日間精密度分別為8.2%、7.8%、2.8%與9.5%、6.7%、2.8%。空白小鼠肝臟中未檢出UV-327、UV-328和UV-320。結果表明，本方法的準確度和精密度良好。

2.5 提取回收率與基質效應

如“2.4”所述，制備低、中、高3種加標濃度(0.20、2.00、16.0 μg/mL)的質控樣品，按照“1.2.2”所述方法處理，每種濃度做6個平行樣，測得的UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比記為A。另取空白小鼠肝臟勻漿100 μL，加入1.0 mL正己烷-丙酮(體積比1∶1)，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min，氮氣吹干后，加入0.40 μg/mL UV-320溶液和一定濃度的 UV-327和UV-328混合標準溶液各100 μL，使加標樣品中UV-327和UV-328最終質量濃度分別為0.20、2.00、16.0 μg/mL，每種濃度做6個平行樣，測得的UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比記為B。計算提取回收率(E%)=A/B×100。用甲醇分別配制質量濃度為0.20、2.00、16.0 μg/mL的UV-327和UV-328混合標準溶液,每種質量濃度做6個平行樣，測定其與UV-320(0.20 μg/mL)的峰面積比記為C，計算基質效應(ME%)=B/C×100。3種加標濃度的質控樣品中UV-327和UV-328的提取回收率分別為97.6%、98.9%、94.2%與97.8%、95.3%、94.3%；基質效應分別為110.8%、99.2%、92.5%與112.3%、100.7%、92.3%。結果表明，本方法的提取回收率高，樣品的基質效應對測量結果的影響較小。

2.6 穩定性

如“2.4”所述，制備低、中、高3種加標濃度(0.20、2.00、16.0 μg/mL)的質控樣品，每種濃度取6個平行樣，考察室溫下放置6 h及-40 ℃下保存15 d條件下，樣品中UV-327和UV-328的穩定性。3種加標濃度的質控樣品室溫下放置6 h，UV-327和UV-328測定值的相對偏差分別為5.0%、1.5%、1.0%與5.0%、1.5%、0.1%；-40 ℃放置15 d，UV-327和UV-328測定值的相對偏差分別為10%、4.0%、1.3%與10%、1.5%、0.9%。結果表明，小鼠肝臟樣品室溫下至少可以放置6 h，-40 ℃冰箱中可以保存15 d。

2.7 實際樣品測定

對小鼠單次灌胃分別給予UV-327或UV-328，采用上述建立的高效液相色譜法測定其肝臟中UV-327或UV-328的含量。圖2a和圖2b分別為灌胃4 h小鼠肝臟中UV-327、UV-328測定的色譜圖。如圖所示，UV-327或UV-328與內標UV-320可完全分離，峰形良好。灌胃4 h，小鼠肝臟中UV-327、UV-328的平均濃度(n=5)分別為10.4 μg/mL和8.43 μg/mL。

圖2 實際樣品測定的色譜圖Fig.2 Chromatograms of real samplesa.chromatogram of UV-327 after 4 h gavage in mice liver;b.chromatogram of UV-328 after 4 h gavage in mice liver.

3 結論

本文以小鼠肝臟為樣品，建立了小鼠肝中UV-327和UV-328的高效液相色譜測定方法，方法的準確度、精密度和靈敏度均可滿足實際樣品中UV-327和UV-328含量的測定要求，且樣品預處理方法簡便快速，使用的有機試劑毒性相對較低、量少，對環境的污染小，方法具有一定的實際應用價值。