超高效液相色譜-高分辨質譜測定10種植物內源激素

汪 瑾， 戴 琳， 王安琦， 盧亞萍*

(南京農業大學生命科學學院生命科學實驗中心，江蘇南京 210095)

植物激素是一類小分子化合物，參與植物的抗生物和非生物脅迫[1,2]。植物激素通常分為六大類，包括生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯和油菜素甾醇[3]。植物激素一般是極低濃度的植物內源物質，需要使用合適的方法來提取富集。用于分析植物激素的樣品制備過程，包括采樣、提取、純化和濃縮，己成為快速分離以及痕量植物激素超靈敏分析的一個瓶頸[4]。

植物組織中植物激素的濃度和分布受溫度、水情、空氣濕度和光照強度等條件的影響[5]。因此，從植物中分離組織后，需要立即將收集的新鮮組織凍結在液氮中。然后選取合適的提取溶劑，理想的提取溶劑能夠高效率地從樣品中提取盡量多種類的植物激素。用于激素提取的溶劑包括甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇等[6]。樣品前處理對實驗結果產生很大的影響[7]。前處理技術，包括液-液萃取、固相萃取、分子印跡萃取、免疫親和純化等，現已被用于從粗提物中進一步純化痕量植物激素[8]。檢測技術一般包括生物測定法、免疫測定法、電分析法、色譜法以及質譜法[9-12]。色譜和質譜聯用技術具有強分離能力，高靈敏性、選擇性和準確性，已成為激素測定的強有力的工具。因此，液相色譜-四極桿飛行時間-質譜(LC-qTOF-MS)方法現已被用于測定痕量植物激素[13-15]。

本研究的目的在于建立一種利用LC-qTOF-MS測定植物中常見的內源激素(赤霉素、脫落酸、細胞分裂素、茉莉酸、水楊酸)的快速高效的方法，為激素的功能、相互作用等研究奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters G2-XS Q-TOF質譜儀(美國，Waters公司)，配有電噴霧(ESI)離子源；SpeedVac真空離心濃縮儀(美國，Thermo Fisher公司)。

10種植物激素標準品(純度均>97%)：脫落酸(ABA)、赤霉酸(GA)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MJ)、吲哚乙酸(IAA)、異戊烯腺嘌呤(IP)、玉米素(ZT)、玉米素核苷(ZR)、獨腳金內酯(SL)，均購自上海源葉生物科技有限公司。將10種標準品用甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的母液，使用時稀釋。甲醇、乙腈、丙酮、甲酸和NH4Ac為色譜純，購自Merck Millipore公司；其他試劑為國產分析純。

小麥、水稻、煙草、棉花、番茄、擬南芥來自江蘇農科院種質資源與生物技術研究所，溫室培養。

1.2 樣品提取

取幼苗期的各種植物材料，用液氮研磨破碎后，稱取100 mg，分別加入1 mL不同的樣品提取液(1:66.7%異丙醇+1%甲酸；2:80%丙酮+1%甲酸；3:80%甲醇+1%甲酸；4:乙腈；5:乙腈+1%甲酸)，超聲提取60 min，13 000 r/min離心10 min，收集上清液。沉淀中再加入0.5 mL樣品提取液振蕩10 min，13 000 r/min離心10 min，收集上清液。合并兩次上清液，用真空離心濃縮儀揮干后，重新溶解于含0.1%甲酸甲醇中。

1.3 固相萃取

用1 mL 純甲醇淋洗固相萃取小柱兩次，再用1 mL 0.1%甲酸淋洗柱子兩次。將10%甲醇(含0.1% 甲酸)溶解的樣品加入到柱子里，用1 mL 0.1%甲酸淋洗柱子，最后用1 mL 80%甲醇(含0.1% 甲酸)洗脫兩次。洗脫后的組分用真空離心濃縮儀揮干，復溶于0.2 mL 80%甲醇(含0.1% 甲酸)中，待測。

1.4 液相色譜-質譜檢測條件

色譜條件：色譜柱：UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm；美國Waters公司)；流動相A為0.1%甲酸+2 mmol/L NH4Ac(正離子)，或2 mmol/L NH4Ac(負離子)；流動相B為甲醇。洗脫條件如下：0～11 min，5%～95%B；95%B淋洗柱子，然后恢復到起始組分5%B。進樣量2 μL；柱溫35 ℃。

質譜條件：毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：40 V；源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；碰撞能量：10～50 eV；比掃描范圍：m/z50～1 000；亮氨酸腦啡肽(LE)用于質量校正。

1.5 數據分析

質譜數據采集和分析使用 Waters Masslynx 4.1軟件。實驗數據為三次重復平均值，表示為平均數值±標準偏差(SD)。采用StudentT檢驗對實驗數據進行比較，當p<0.05時，認為有顯著性差異；當p<0.01時，認為差異極為顯著；當p>0.05時認為沒有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇及優化

色譜柱及流動相的選擇會對化合物的分離度和峰形產生重要的影響[19，20]。液相色譜-質譜分析中，有機流動相一般采用乙腈或甲醇，同時也會添加一定量的酸和鹽以提高離子化效率、改善峰形。本研究比較了乙腈和甲醇的分離效果，發現兩者沒有顯著差異，于是選擇了毒性較小、成本較低的甲醇作為有機相。同時在正離子模式下，流動相A(ddH2O)中添加了0.1% 的甲酸及2 mmol/L的NH4Ac，負離子模式下流動相A中添加了2 mmol/L的NH4Ac，達到了良好的離子化效率和分離效果。

2.2 10種常見植物內源激素的定性分析

在MS/MS采集模式下，對10種化合物進行一級全掃描和二級碎片檢測。正離子模式下，IAA、IP、ZR、ZT、SL和MJ有較好的響應度，而ABA、GA3、JA和SA在負離子模式下響應度較好，提取離子色譜圖如圖1、圖2。在MS/MS 模式下，以[M+H]+或[M-H]-離子為母離子得到二級碎片離子的質譜信息列于表1。選擇豐度相對較高的子離子作為特征碎片離子，各物質的一級、二級色譜圖、質譜圖及結構信息如圖3、圖4。

2.3 10種植物內源激素的定量測定

將10種激素標準品溶液稀釋為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，對每個梯度的樣品進行質譜測定，采集模式為MS、MS/MS或MRM。采用不同的采集模式時，各種激素的響應度不同，其中MS的響應度最高，而MS/MS及MRM模式下的響應度會降低1～2個數量級。因此采用MS模式對各種激素進行定量測定，制作標準曲線，確定其檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，測定結果列于表2。所有的激素樣品在稀釋濃度范圍內具有較好的線性關系，相關系數R2達到0.99以上。每種樣品檢測限和定量限相差很大，其中IP，ZR定量限為0.1 ng/mL，是所測激素中質譜響應度最高的。

圖1 正離子模式下6種植物激素的提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of six plant hormones in positive ion mode

圖2 負離子模式下4種植物激素的提取離子色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatograms of four plant hormones in negative ion mode

圖3 正離子模式下6種植物激素的一級、二級質譜圖及碎片結構信息Fig.3 MS,MS/MS and structure elucidation of six plant hormones in positive ion mode

表1 10種植物激素的質譜信息

圖4 負離子模式下4種植物激素的一級、二級質譜圖及碎片結構信息Fig.4 MS,MS/MS and structure elucidation of four plant hormones in negative ion mode

2.4 10種植物激素添加回收實驗

選用目標植物激素含量低于檢測限的植物樣品作為空白基質，分別加入3個濃度(10、50、200 ng/mL) 的激素標品混合物，通過Waters HLB固相萃取小柱回收后，測定回收前后的質譜響應值，計算測定濃度及回收率，測定結果見表3。對于濃度為200、50 ng/mL激素樣品，回收率可達到90%以上；而對于濃度為10 ng/mL 的樣品，回收率偏低。其中SL的回收率最低，為77.8%，ZT的回收率最高，為92.6%。

表3 10種植物激素的添加回收率和相對標準偏差(n=3)

2.5 不同的樣品提取液和溶劑對激素提取效率的影響

選取5種試劑從煙草幼苗中提取激素。5種提取液分別是：(1)66.7%異丙醇+1%甲酸；(2)80%丙酮+1%甲酸；(3)80%甲醇+1%甲酸；(4)乙腈；(5)乙腈+1%甲酸。不同提取液的提取效果如圖5。丙酮作為提取劑，提取液顏色很深，說明其中溶解了很多的葉綠素，會對后續的樣品前處理和樣品測定造成較大影響。異丙醇和乙腈的提取效果相對更好，而乙腈提取時IP的響應值明顯優于異丙醇。加入1%甲酸對乙腈的提取效果有更好的提高作用。對于煙草樣品中含量較高的成分IP、 ZR、 ZT、 SA，使用乙腈+1%甲酸作為提取液，提取效果明顯優于其余幾種提取液。

為了考察不同的溶劑復溶對于激素溶解和測定的影響，將提取后的激素初提液旋轉揮干后溶于20%～100%的甲醇中，通過LC-MS測定其質譜響應值，結果見表4。對于IP，ZT和SA，在80%甲醇中檢測信號最強，而ZR在100%甲醇中檢測到的信號最強。100%甲醇溶解時溶液中葉綠素含量較高。綜合考慮，選用80%的甲醇作為溶劑復溶激素提取物。

在提取過程中，比較了振蕩提取和超聲提取的提取效果，以及提取時間對提取效果的影響。結果發現，超聲提取的植物激素的量大于振蕩提取，并且提取60 min可達最佳效果。在對樣品粗提液進行濃縮干燥時，我們比較了使用氮吹儀和離心濃縮儀的效果。兩種儀器的處理對于植物激素的影響程度沒有顯著區別，因此選擇速度更快的真空離心濃縮儀作為處理儀器。

實驗還比較了漢邦C18柱、安普C18柱和MAX(陰離子交換吸附柱)的純化效果，兩種C18柱的回收效果略低于Oasis HLB小柱，而MAX柱在本實驗中對于酸性化合物的回收效率并未顯著高于HLB小柱，因此選用HLB柱作為標準品和植物樣品的萃取柱。

2.6 植物材料中激素的測定

選取幾種植物材料幼苗，按優化的提取及測定方法，通過高分辨率飛行時間-質譜，采用一級全掃描的方式測定其質譜響應值，并根據標準曲線計算各種激素的含量。從100 mg水稻、小麥、煙草、棉花、番茄、擬南芥幼苗中，檢測到了IAA、IP、ZR、ZT、ABA、GA3、JA、SA(表5)，而SL和MJ含量低于定量限，未檢出。

表5 幾種植物材料中植物激素的定量結果(ng/g FW)

3 結論

本研究優化了從植物樣品中提取和純化激素，并利用超高效液相色譜-高分辨率質譜進行定性定量測定。10種激素在質譜上均有良好的響應，檢測限為0.05～5 ng/mL，定量限為0.1～10 ng/mL。采用含1%甲酸的乙腈超聲浸提小麥、水稻、煙草、棉花、番茄和擬南芥幼苗粉末，然后用固相萃取小柱進行樣品前處理，最后用80%甲醇復溶，采用質譜全掃描模式測定各種植物激素的含量。本實驗建立了簡便快速提取和測定植物激素的分析方法。