高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中7種硒形態(tài)

陸奕娜*， 張林田， 魏建華， 陳建偉， 呂堅(jiān)羚

(汕頭海關(guān)技術(shù)中心,廣東汕頭 515041)

硒是人體必需的一種微量元素[1]。硒參與合成人體內(nèi)多種含硒酶和含硒蛋白[2]，也是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性中心[3]。流行病學(xué)調(diào)查表明，飲食中硒攝入量與乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌的死亡率呈明顯的負(fù)相關(guān)性[4,5]。硒與維生素E、大蒜素、亞油酸、鍺、鋅等營(yíng)養(yǎng)素具有協(xié)同抗氧化作用[6]，增強(qiáng)抗氧化活性。另外，硒具有減輕和緩解重金屬毒性的作用[7]。缺硒是克山病、大骨節(jié)病兩種地方性疾病的主要病因[8,9]。硒能徹底清除對(duì)人體有害的自由基[10]，修復(fù)細(xì)胞組織的損傷[11]。同時(shí)硒也具有毒性,硒攝入量過(guò)多，對(duì)人體會(huì)造成危害,當(dāng)日均攝入量為750～950 g時(shí)，則會(huì)引起硒中毒[10]。人、馬及牛一次服用硒的最小致死劑量分別為2～4 mg/kg體重、1.5 mg/kg體重、45～5 mg/kg體重[12]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的成年人攝入量為50～200 μg/d[6]。硒的毒性和生物利用度在很大程度上取決于硒的化學(xué)形態(tài)，硒酸鹽及亞硒酸鹽毒性較大[13]，亞硒酸鈉的毒性略大于硒酸鈉[14]，硒化氫的毒性最大[15]，會(huì)導(dǎo)致生物體病變，在日本1993年已禁止在食品和飼料中添加無(wú)機(jī)硒[16,17]。硒代蛋氨酸等有機(jī)硒則是人類(lèi)攝取硒元素的主要來(lái)源[18]，不同硒形態(tài)的毒性亦不同，因此無(wú)論對(duì)食品安全、環(huán)境樣品，還是從事與硒有關(guān)的工作人員或硒中毒患者的體液進(jìn)行硒形態(tài)分析和監(jiān)測(cè)都是有必要的，準(zhǔn)確地定性定量分析不同形態(tài)和價(jià)態(tài)的硒對(duì)保障食品安全生產(chǎn)、人類(lèi)健康具有重要意義。

國(guó)內(nèi)尚無(wú)多種硒形態(tài)同時(shí)測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，目前報(bào)道硒形態(tài)的檢測(cè)方法主要有分光光度法、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法、液相色譜法等，但均存在樣品前處理復(fù)雜或檢測(cè)硒形態(tài)種類(lèi)較少等不足，效率低。高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)具有接口簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛、檢出限低、分離效率及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在元素形態(tài)分析上具有一定的優(yōu)勢(shì)。目前有報(bào)道利用HPLC-ICP-MS測(cè)定食品中硒形態(tài)，但檢測(cè)的硒形態(tài)種類(lèi)較少[19]。本文采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)，建立了同時(shí)快速測(cè)定食品中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)、硒脲(SeUr)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代乙硫氨酸(SeEt) 7種硒形態(tài)的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器及操作條件

美國(guó)安捷倫Agilent 1200 高效液相色譜儀，配四元泵及自動(dòng)進(jìn)樣器。HPLC條件：安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(用甲酸調(diào)pH至4.4)，等度洗脫，流速為0.8 mL/min，1 min內(nèi)流速逐步升至1.2 mL/min，5～10 min，流速為1.2 mL/min。美國(guó)安捷倫Agilent 7700X 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀。ICP-MS條件：射頻功率1 450 W，測(cè)質(zhì)量數(shù)78Se，采樣周期為0.8 s，采集時(shí)間為600 s，載氣為高純氬氣，同心霧化器，載氣流量為1.00 L/min。國(guó)產(chǎn)科貝爾CBL C9860A 型超聲波萃取儀；德國(guó)海蒂詩(shī)Hettich高速離心機(jī)；國(guó)產(chǎn)恒奧公司HGN-24A氮吹儀；美國(guó)密理博Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)。

1.2 試劑

硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：Se(Ⅳ)(GBW10032,濃度68.9±1.4 μg/g)、Se(Ⅵ)(GBW10033,濃度75.1±2.4 μg/g)、SeCys2(GBW10087,濃度93.5±2.5 μg/g)、SeMeCys(GBW10088,濃度96.6±2.6 μg/g)、SeMet(GBW10034,濃度97.9±2.5 μg/g)、SeUr(213170010 A0369556)、SeEt(Cat#S250000)，均購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，使用前用水配制成1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于0～5 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

比較了5種樣品提取方式：(1) 水提取法[20]：稱(chēng)取樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL水，混均，超聲萃取2 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min，取清液過(guò)0.45 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶。(2) 10 mmol/L檸檬酸(pH=5.60)提取法[21]：稱(chēng)取樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL濃度為10 mmol/L檸檬酸(pH=5.60)，混均，超聲萃取2 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10min，取清液過(guò)0.45 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶。(3) 0.1 mol/L HCl提取法[19]：稱(chēng)取樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL濃度為0.1 mol/L HCl，混均，超聲萃取2 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min，取清液過(guò)0.45 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶。(4) 甲醇-水提取法[20]：稱(chēng)取樣品1.00 g于15 mL離心管內(nèi)，加入20 mL甲醇水溶液，混勻，超聲萃取2 h，50 ℃ 吹氮濃縮至1～2 mL，冷卻，加入少許去離子水轉(zhuǎn)移至10 mL離心管內(nèi)，定容至10 mL，取清上液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min， 取上清液過(guò)0.45 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶(注意甲醇不能完全蒸干，否則影響提取效率)。(5) 水-酶提取法[20]：稱(chēng)取樣品1.00 g于25 mL離心管中，加20 mL水，超聲10 min，加入20 mg蛋白酶XⅣ，在37 ℃的恒溫水浴搖床上振蕩8 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min，取清上液過(guò)0.45 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶。

取所得上清液50 μL引入HPLC-ICP-MS儀進(jìn)行測(cè)定。如果離心后的溶液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，則將離心機(jī)溫度設(shè)置為0 ℃重新離心，樣品中的油脂分層凝固在離心管上層，用小勺小心去除；或離心完成后將離心管置于冰箱冷藏保存2～3 h以上，取出后去除上層油脂層，取1 mL溶液再過(guò)0.45 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶，供HPLC-ICP-MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇分別采用安捷倫TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、安捷倫XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、AichromBond-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、資生堂Shiseido C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Hamilton PRP-X100陰離子分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm)、安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)對(duì)硒形態(tài)進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)表明，Hamilton PRP-X100陰離子分析柱(250 mm×4.1 mm,10μm)能有效分離出5種硒形態(tài)，色譜圖見(jiàn)圖1a；安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱能有效分離出7種硒形態(tài)，色譜圖見(jiàn)圖1b；其他4種色譜柱均出現(xiàn)色譜峰重疊的情況。因此采用安捷倫ZORBAX SB-Aq C18反相色譜柱。

圖1 采用Hamilton PRP-X100色譜柱(a)及安捷倫SB-Aq C18色譜柱(b)分離的色譜圖Fig.1 Chromatograms using Hamilton PRP-X100 ion column and Agilent SB-Aq C18 reversed phase column

2.1.2 流動(dòng)相的選擇本實(shí)驗(yàn)分別采用5 mmol/L檸檬酸(pH=4.7)、40 mmol/L (NH4)2HPO4(pH=6.0)、20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(pH=4.4)等多種不同的流動(dòng)相對(duì)硒形態(tài)進(jìn)行分離，5 mmol/L 檸檬酸(pH=4.7)、40 mmol/L(NH4)2HPO4(pH=6.0)最多只能分離出5種硒形態(tài)，20 mmol/L 檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(pH=4.4)能有效分離出7種硒形態(tài)。最終確定采用20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(pH=4.4)作為硒形態(tài)色譜分離的流動(dòng)相。

2.1.3 柱溫的選擇設(shè)置柱溫分別為20、22、24、26、30、32 ℃對(duì)7種硒物質(zhì)進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)表明，不同柱溫對(duì)7種硒形態(tài)的分離檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響。因此，將柱溫設(shè)置為室溫，利用空調(diào)及抽濕機(jī)保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境的一致性。

2.2 樣品前處理過(guò)程的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇選擇上述5種提取液對(duì)富硒酵母進(jìn)行超聲萃取，對(duì)應(yīng)添加濃度為100 μg/kg的7種硒化合物，并將處理完畢的上清液進(jìn)行HPLC-ICP-MS檢測(cè)，對(duì)比5種提取液對(duì)7種硒形態(tài)的萃取效果。7種硒化合物的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.1 mol/L HCl 、10 mmol/L 檸檬酸(pH=5.6)溶液提取各硒形態(tài)分離效果較差，峰形不突出，回收率較差；甲醇-水(1∶l)、水-酶及水3種溶劑提取效果相近，但是甲醇-水(1∶l)的前處理過(guò)程比較復(fù)雜，甲醇毒性較大，且高含量的甲醇進(jìn)入ICP-MS儀容易使矩管積碳，因此還必須通過(guò)蒸發(fā)儀或吹氮儀將甲醇除去，前處理繁瑣、步驟多，提取時(shí)間較長(zhǎng)；水-酶法提取過(guò)程需要37 ℃的恒溫水浴搖床上振蕩8 h，提取時(shí)間較長(zhǎng)，且酶的價(jià)格相對(duì)較高。因此，本實(shí)驗(yàn)采用效率最高、安全性較大且前處理時(shí)間較短的水提取法。

表1 不同前處理對(duì)富硒酵母硒形態(tài)結(jié)果的影響(n=3)

2.2.2 提取時(shí)間選擇取富硒酵母膠囊、富硒片劑兩種含硒較豐富的產(chǎn)品，按萃取時(shí)間分別為60、90、120、150、180 min進(jìn)行萃取，結(jié)果表明萃取時(shí)間為120 min時(shí)，萃取效果最佳，既可保證最大提取效率，又可節(jié)約分析時(shí)間。

2.2.3 提取次數(shù)的影響以麥胚芽、茶葉等為研究對(duì)象，以7種硒化合物為主要參考指標(biāo)，10 mL去離子水超聲提取120 min，混均，取上清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心15 min，過(guò)0.45 μm濾膜，吸取上清液為第一次提取液。殘?jiān)儆锰崛∫禾崛。貜?fù)操作二次。將上述三次提取液按規(guī)定的凈化步驟處理后上機(jī)測(cè)定，比較三次提取液的測(cè)定值。結(jié)果表明超聲提取一次，被測(cè)物基本已經(jīng)提取完全，僅有很少一部分被測(cè)物殘留在殘?jiān)?約占5%或檢不出)。第三次提取液中7種硒形態(tài)化合物均為未檢出。綜合考慮本研究確定的提取次數(shù)為一次。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性將濃度分別為2.5、5、10、20、50、100 μg/L的7種硒化合物混合溶液，分別在低溫避光(棕色瓶0～5 ℃冰箱)及常溫不避光條件下存放，3、10、20、30 d后檢測(cè)，在低溫及避光環(huán)境下，高濃度的7種硒形態(tài)，除了SeUr及SeEt兩種硒形態(tài)外，其他5種硒形態(tài)的計(jì)數(shù)較為穩(wěn)定，低濃度下的5種硒形態(tài)隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度會(huì)出現(xiàn)一定程度的下降趨勢(shì)，但是SeUr及SeEt兩種硒形態(tài)無(wú)論是高濃度溶液或者低濃度溶液，濃度隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)急劇下降。

在常溫及光照環(huán)境下，7種硒形態(tài)的濃度均隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)而變化，除了Se(Ⅳ)外，其他6種硒形態(tài)基本隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。無(wú)論時(shí)高濃度還是低濃度的硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液在常溫條件下均處于不穩(wěn)定狀態(tài)，光照會(huì)使硒形態(tài)的化學(xué)狀態(tài)發(fā)生變化，如硒脲光照及一定的溫度會(huì)發(fā)生分解，有效濃度的硒脲溶液應(yīng)是淺粉色的，隨著光照及存放時(shí)間的增加分分解變成無(wú)色液體。有些硒形態(tài)會(huì)發(fā)生化學(xué)還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化成Se(Ⅳ)，因此，Se(Ⅳ)的濃度反而隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。

由于硒形態(tài)的化學(xué)不穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)溶液一般是現(xiàn)配現(xiàn)用；購(gòu)買(mǎi)回的樣品及處理完畢的待測(cè)液要存放在避光及低溫環(huán)境中，并盡快上機(jī)檢測(cè)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及定量限

配制濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet、SeEt標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列，按建立的方法進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分峰面積計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo)(y)，被測(cè)組分濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。結(jié)果表明，Se(Ⅵ) 、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet、SeEt 7種硒化合物在2.5～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均>0.999。回歸方程、相關(guān)系數(shù)、各被測(cè)組分保留時(shí)間列于表2。

表2 線(xiàn)性參數(shù)及檢測(cè)限

采用濃度為2.5 μg/L的7種硒化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，以3倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限，再根據(jù)本方法所規(guī)定的取樣量計(jì)算方法檢測(cè)限。最終確定食品中Se(Ⅵ) 、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet、SeEt 7種形態(tài)化合物的檢測(cè)限均為0.005 mg/kg。

2.4 精密度與回收試驗(yàn)

2.4.1 陰性樣品驗(yàn)證取陰性樣品多維素、大米、蒜頭、茶葉做代表，以檢測(cè)限的1倍、2倍、10倍添加水平，添加7種硒形態(tài)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按本研究制定的方法進(jìn)行檢測(cè)，在不同時(shí)間檢測(cè)6次，計(jì)算6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。多維素、大米、蒜頭、茶葉在1倍、2倍、10倍檢測(cè)限添加水平的6次測(cè)定結(jié)果的RSD在1.62%～18.48%之間，其中被測(cè)組分含量10 μg/kg內(nèi)，6次測(cè)定結(jié)果的RSD在<18.48%；被測(cè)組分含量10 μg/kg內(nèi)，6次測(cè)定結(jié)果的RSD<12.7%。

取陰性樣品多維素、大米、蒜頭、茶葉，按以上方法添加7種硒形態(tài)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(5、10、50 μg/kg)，按本研究制定的方法進(jìn)行檢測(cè)，在不同時(shí)間檢測(cè)6次，計(jì)算回收率，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。多維素、大米、蒜頭、茶葉樣品在1倍、2倍、10倍檢測(cè)限添加水平的回收率在71.9%～116.7%之間。

2.4.2 陽(yáng)性樣品進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證取富硒酵母陽(yáng)性樣品，按本研究制定的方法進(jìn)行檢測(cè)，在不同時(shí)間檢測(cè)6次，計(jì)算6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，驗(yàn)證方法的重復(fù)性，SeCys2、 SeMeCys及SeMet含量在100 mg/kg以?xún)?nèi)，RSD<3.56%，Se(Ⅳ) 含量在10 mg/kg以?xún)?nèi)，RSD為6.26%，Se(Ⅵ)、SeUr、SeEt含量在1 mg/kg以?xún)?nèi)RSD<10.45%。

2.5 樣品分析

將建立的方法用于食品中硒形態(tài)分析，其結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出，除了富硒酵母外，大部分產(chǎn)品含硒都較低。富硒保健食品中的富硒酵母，其硒成分以SeMet為主；富硒糧谷類(lèi)食品的硒成分以SeCys2為主；水產(chǎn)品含有一定量的硒，硒成分以SeMeCys為主。某些標(biāo)為富硒產(chǎn)品，如富硒茶葉的樣品檢出的硒成分含量較低，小于標(biāo)簽標(biāo)注的含量；富硒蒜頭、富硒番薯、富硒玉米粉等未檢測(cè)出硒成分。

表3 市售產(chǎn)品7種硒形態(tài)檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)食品中硒形態(tài)檢測(cè)的色譜條件、質(zhì)譜條件及前處理進(jìn)行優(yōu)化，建立了HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)食品中的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet和SeEt共7種硒形態(tài)含量的分析方法。方法樣品前處理簡(jiǎn)便快捷，試劑無(wú)毒無(wú)害，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高，定量精準(zhǔn)，滿(mǎn)足食品中無(wú)機(jī)硒和多種有機(jī)硒形態(tài)分析的需要，為食品中硒形態(tài)的分析鑒定提供了切實(shí)可行的方法依據(jù)。