Loop長度對G -四鏈體DNA識別和結合腫瘤細胞的能力的影響

梅秋毫， 盧珊珊， 甄笑笑， 張 楠*

(1.中國科學院化學研究所，北京 100190；2.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌 443000)

G -四鏈體是由富含串聯重復鳥嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的核酸二級結構。人的基因組中，特別是啟動子區存在許多可形成G -四鏈體的序列，這些序列涉及基因復制、轉錄、重組等多種生理[1,2]和癌癥、糖尿病和心血管病等疾病的發生病理[3]過程，可作為藥物設計的靶標。人工合成的G -四鏈體DNA也被發現具有如抗腫瘤活性等多種生物學活性[4,5]，如AS1411是一種抗增殖的富G核苷酸序列，能夠特異性識別核仁素，從而實現癌癥的靶向治療[6]。

核酸適配體(Aptamer)是通過指數富集的配體系統進化(Systematic Evolution of Ligands Exponential Enrichment,SELEX)技術，篩選出來的一類功能寡聚核苷酸，具有特異性識別能力。近年來，特異性靶向腫瘤細胞核酸適配體的篩選和應用是該領域的研究熱點，將這類核酸適配體作為分子探針可實現體內腫瘤細胞的早期發現和成像定位，同時核酸適配體藥物綴合物在靶向藥物治療方面具有極大的應用前景[7,8]。目前文獻報道的很多核酸適配體都具有G -四鏈體結構，如靶向肝細胞生長因子受體核酸適配體CLN0003[9]、靶向stat3核酸適配體T40214[10]、靶向核仁素核酸適配體AS1411[6,10]等。這些靶向識別腫瘤細胞表面受體的核酸適配體的DNA序列傾向于形成G -四鏈體結構，提示核酸適配體對腫瘤細胞的結合能力可能與其G -四鏈體結構有關。我們實驗室的前期研究發現，G -四鏈體對腫瘤細胞具有普遍的識別和結合能力，并初步驗證了G -四鏈體細胞結合能力與細胞表面的核仁素等蛋白具有相關性[11]。

G -四分體是G -四鏈體的結構單元，由Hoogsteen氫鍵連接4個G形成環狀平面，兩層或以上的G -四分體通過π-π堆積形成G -四鏈體，而G四分體之間由1～7個核苷酸連接，這些連接G -四分體的核苷酸被稱為loop環。一般G -四鏈體核酸一級序列為5′-GnXmGnXmGnXmGn-3′(X為A、T、C或G，m=1～7，n=2或3)，X即為串聯G四分體的loop環。前期研究發現loop環不同的G -四鏈體DNA對腫瘤的抑制增殖作用不同[12]。對于G -四鏈體DNA，G -四分體相同，而loop環可以不同，因此loop環的堿基種類和個數決定了G -四鏈體的構型和功能。目前，G -四鏈體DNA的loop環對其腫瘤細胞識別和結合作用的影響未見報道；探索G -四鏈體結構如loop環長度等對其識別和結合腫瘤細胞能力的影響，將對設計合成特異性靶向腫瘤細胞的核酸適配體，以及具有抗腫瘤增殖活性的寡核苷酸具有指導意義。本文通過圓二色光譜和抗動物血清核酸酶穩定性實驗，考察loop長度對G -四鏈體DNA構型的影響；利用流式細胞術和激光共聚焦成像，考察G -四鏈體DNA與腫瘤細胞的表面結合和被攝取情況，從而確定loop長度對G -四鏈體DNA識別和結合腫瘤細胞的能力的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

J-815型圓二色光譜儀(日本，JASCO公司)；NANODROP 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher scientific公司)；DYY-10C垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；DNR Bio Imaging Systems凝膠成像系統(以色列，DNR成像系統有限公司)；BD FACSCalibur流式細胞儀(美國，Beckman Dickson公司)；OLYMPUS IX83 激光掃描共聚焦顯微鏡(日本，奧林巴斯)。

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(TEMED)、牛血清白蛋白(BSA)購自美國Amresco公司；EDTA及其他化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑北京有限公司。RPMI-1640培養基、DMEM培養基、胰蛋白酶均為Gibco品牌，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。胎牛血清(FBS)系南美血源，購自德國PAN公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)，洗滌緩沖液(Washing Buffer,WB)為含5 mmol/L MgCl2和0.9 g/L葡萄糖的PBS，結合緩沖液為含0.5 mg/mL鯡魚精DNA和1 mg/mL BSA的WB。人正常胚腎成纖維細胞(HEK293)、人子宮頸癌細胞(HeLa)購自中國科學院上海細胞庫；耐阿霉素的荷爾蒙依賴性乳腺癌細胞(MCF-7/ADM)購自上海艾研生物技術公司；急性T細胞白血病細胞(Jurkat E6-1)購自醫學科學院基礎醫學研究所(北京)；人前列腺癌細胞(PC3)、人結腸癌細胞(LoVo)、人前列腺癌細胞(DU145)、人膀胱癌細胞(T24)、耐紫杉醇人卵巢癌細胞(A2780T)等均購自北京協和細胞庫。

本實驗設計了一組不同loop長度的G -四鏈體DNA(G4L1、G4L2和G4L3，loop長度分別為1 nt、2 nt 和3 nt)，以及一個不含G的對照DNA序列(Ctr sq)，具體序列信息詳見表1。為了便于檢測，同時合成了一組在5′端標記有熒光素(FAM)的G4L1、G4L2、G4L3和Ctr sq，分別命名為F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3 和F-Ctr(下文統稱為F-DNA)。所有DNA均由生工生物工程(上海)有限公司合成和純化。

表1 G -四鏈體DNA名稱與一級序列

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA樣品的制備DNA凍干粉用PBS溶解，OD260標定濃度，標定至濃度為40 μmol/L；F-DNA凍干粉用同樣的方法標定至濃度為20 μmol/L。兩種DNA母液通過95 ℃加熱變性5 min，再置于冰上復性10 min，而后放于4 ℃冰箱過夜，使其緩慢形成熱力學穩定結構，用于與細胞結合的系列實驗。

1.2.2 圓二色光譜實驗將40 μmol/L的DNA母液用PBS稀釋10倍，制成400 μL 4 μmol/L DNA溶液，室溫放置2 h，而后進行圓二色光譜測定。圓二色光譜儀參數：靈敏度為100，掃描速度為500 nm/s，掃描次數為3次，掃描范圍200～400 nm。數據用origin8.1軟件進行處理。

1.2.3 抗核酸酶穩定性實驗將5′端標記有FAM的不同的G -四鏈體DNA(F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3)和胎牛血清(FBS)在PBS中混合，配制成500 μL混合溶液,其中G -四鏈體DNA的終濃度均為4 μmol/L，FBS的含量均為2%，混勻后置于37 ℃的生化培養箱中孵育。分別在孵育0 min、15 min、30 min、1 h、8 h和24 h后，取3種不同的G -四鏈體DNA的混合孵育液50 μL，各加1 μL EDTA，渦旋振蕩5 s，95 ℃變性5 min以降解血清中核酸酶活性，然后置于-20 ℃下保存。待所有樣品取樣結束后，樣品中加入上樣緩沖液，95 ℃變性5 min后，進行凝膠電泳分析。20%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，含7 mol/L的脲作為變性劑，電解緩沖液使用1×TBE(89 mmol/L Tris+2 mmol/L EDTA+2 mmol/L硼酸，pH為8.4)，電壓為120 V，電泳2 h。

1.2.4 流式細胞分析所有細胞均在37 ℃、5%CO2的培養箱中用1640培養基(含10%FBS)培養。細胞根據生長周期，待生長密度約為70%～80%時傳代。分別將培養48 h的細胞(HEK293、HeLa、MCF-7/ADM、Jurkat E6-1、PC3、LoVo、DU145、T24和A2780T)與熒光標記的G -四鏈體DNA在結合緩沖液中進行孵育，然后用流式細胞儀進行分析。每種細胞的孵育實驗均設計成5組，分別為空白對照組(cells only)、對照序列組(F-Ctr)、F-G4L1組、F-G4L2組和F-G4L3組。每組均為將相應的F-DNA加入細胞溶液中(空白組不加)混合，孵育液的體積為200 μL，F-DNA的終濃度均為200 nmol/L。在冰上孵育30 min后，用洗滌緩沖液洗滌，用流式細胞儀進行數據采集，檢測的數據用Flow Jo軟件處理。加入F-DNA后皆要避光以防熒光猝滅。除Jurkat細胞(不貼壁)外，所有的細胞孵育前，均用5 mmol/L的EDTA消化5～7 min，然后用洗滌緩沖液洗滌。

1.2.5 結合解離常數(Kd值)的測定分別將0、20、40、60、80、100、200 nmol/L的F-G4L1與T24細胞在結合緩沖液中混合，冰上孵育30 min，用洗滌緩沖液洗滌，用流式細胞儀進行熒光數據采集。所得數據用Flow jo和Graphpad軟件處理。

1.2.6 胰酶消化實驗實驗設計成兩個大組，即EDTA消化組和胰酶消化組：兩皿T24細胞，生長48 h后，分別用EDTA溶液和胰酶將細胞從培養皿上消化解離，制成單細胞分散液。胰酶消化組是向皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，消化2 min，再用1 mL 1640培養基(含10%FBS)終止消化；EDTA消化組是向皿中加入1 mL 5 mmol/L EDTA，消化5～7 min，加入洗滌緩沖液終止消化。兩組細胞離心后，都用洗滌緩沖液洗滌兩次，然后在結合緩沖液中分別與F-G4L1、F-Ctr混合孵育，另外都設一個cells only組(不加F-DNA)。孵育總體積為200 μL，F-DNA終濃度為200 nmol/L，冰上孵育30 min，用洗滌緩沖液洗滌后，上流式細胞儀進行熒光數據采集。用Flow jo軟件處理數據。

1.2.7 激光掃描共聚焦成像分析3×105個T24細胞鋪于玻璃底的激光共聚焦培養皿中，生長約36 h后，取8皿細胞，吸去培養基，用洗滌緩沖液將皿中的細胞洗兩次，再將含有不同F-DNA(F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3和F-Ctr)的結合緩沖液分別加入細胞中，取4皿在4 ℃條件下孵育30 min，另外4皿細胞在37 ℃下孵育30 min，孵育結束后，吸去上清，用洗滌緩沖液洗一次，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察拍照(用488 nm激光光源進行激發，接收范圍為500～600 nm)。制出T24細胞與F-G4L1于37 ℃孵育結合的三位重構圖像。激光共聚焦二維圖像和三維重構圖像用FV31S-SW軟件進行處理。

2 結果與討論

2.1 loop環長度對G -四鏈體DNA拓撲結構的影響

G -四鏈體DNA一級序列5′-G3HnG3HnG3HnG -3′(H為loop堿基，代表A、C、T堿基中的任意一種，n為loop長度)，其中loop比為1∶1∶1、2∶2∶2和3∶3∶3 這三類loop長度比的G -四鏈體序列在人類基因組內分布廣泛，占所有G -四鏈體序列約12%，具有重要的研究價值[13]。因此，為了考察loop環長度對G -四鏈體DNA的構型和結構穩定性的影響，設計了上述三種loop環長度的G -四鏈體，loop環長度分別為1 nt、2 nt和3 nt，并分別命名為G4L1、G4L2和G4L3，序列如表1所示。圓二色(CD)光譜可以反映出G -四鏈體的拓撲結構，反平行結構G -四鏈體DNA其CD光譜在波長290 nm處為正峰，260 nm處為負峰；平行結構G -四鏈體DNA在波長264 nm處為正峰，240 nm處為負峰；混合平行結構則在波長295 nm處為正峰，265 nm處出現正的肩峰，235 nm到240 nm間為負峰[14-16]。如圖1所示，G4L1的CD光譜在波長264 nm處有正峰，240 nm處為負峰，表明G4L1為平行結構；G4L2、G4L3在295 nm處為正峰，235 nm處為負峰，并在264 nm處為正的肩峰，表明都兩者為混合平行結構。上述結果表明，一個堿基長度loop的G -四鏈體DNA傾向于形成平行結構/兩個和三個堿基長度loop的G -四鏈體DNA傾向于形成混合平行結構。這與Hazel等[17]發現loop短的G -四鏈體傾向于形成緊湊的平行結構的現象相符。

2.2 loop環長度對G -四鏈體DNA結構穩定性的影響

圖2 F-DNA與10%FBS在PBS中孵育不同時間的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis of F-DNA in PBS containing 10%FBS at different times

寡核苷酸易被核酸酶分解，而Cao等發現形成G -四鏈體結構的單鏈DNA較穩定，不易被核酸酶分解[18]。為了考察G4L1、G4L2和G4L3是否也在核酸酶下穩定，我們將熒光標記的這三種G四鏈體DNA分別與含有核酸酶的FBS于37 ℃混合孵育不同時間，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對三種G -四鏈體DNA在血清中的降解情況進行分析。結果如圖2所示，在2%FBS孵育中24 h后，F-G4L1的電泳條帶最清晰，而F-G4L2 和F-G4L3的電泳條帶都有輕微地拖尾，說明F-G4L1幾乎沒有降解，而G4L2和G4L3都略有降解。這表明G4L1、G4L2和G4L3耐核酸酶的能力都較強，而G4L1最強，在細胞孵育液中能夠穩定存在。

2.3 loop環長度對G -四鏈體DNA的細胞識別能力的影響

從上述結果可知，loop環長度可影響G -四鏈體DNA的構型，繼而考察不同loop長度的G4L1、G4L2和G4L3與9種細胞(除HEK293細胞為正常細胞外，其余均為腫瘤細胞)的結合情況。將熒光標記的DNA(F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3和F-Ctr)在4 ℃下與細胞在結合緩沖液中孵育，用流式細胞術分析細胞表面熒光情況。如圖3所示，與G4L1、G4L2和G4L3這三種G -四鏈體DNA分別孵育后，PC3、LoVo、Jurkat E6-1和A2780T表面熒光與空白對照相比沒有明顯變化，說明G4L1、G4L2和G4L3與這四種細胞幾乎無結合；而DU145和HEK293與G4L1、G4L2和G4L3有較弱結合；G4L1和G4L2在MCF-7/ADM表面有較強熒光，而G4L3與MCF-7/ADM表面熒光較弱。這說明loop短的G4L1和G4L2與MCF-7/ADM的結合能力比loop長的G4L3強，MCF-7/ADM對G -四鏈體DNA的較強結合能力在以往文獻中也有類似報道[11]；G4L1、G4L2和G4L3在T24表面熒光都比較強，說明這3種G -四鏈體DNA均能夠與T24有較強結合，其中loop最短(1nt)的G4L1熒光強度最大，說明其與T24結合能力最強，T24對G -四鏈體DNA的強結合能力還未見報道，對其結合能力的進一步研究，有助于深入理解G -四鏈體DNA對細胞的結合作用。

圖3 F-DNA與不同細胞相互作用的流式細胞術分析Fig.3 Flow cytometric analysis of interaction between F-DNA with different cells

2.4 G -四鏈體DNA與T24結合能力的考察

圖4 T24與不同濃度F-DNA結合的親和力曲線Fig.4 Binding affinity curve of F-DNA with T24

G4L1與T24的結合能力強，為了考察其在對T24進行定位檢測和靶向藥物運送方面的應用前景，我們對G4L1和T24的相互作用進行了較深入的研究。首先考察G4L1與T24的結合解離常數(Kd)。將不同濃度的F-G4L1分別與T24于冰上混合孵育，用流式細胞術分析測量F-G4L1與T24熒光強度。如圖4所示，兩者的結合親和力曲線對應的Kd值為105.8 nmol/L，這表明G4L1與T24細胞有較強的結合能力，有望能夠用于腫瘤細胞T24的識別診斷和治療。

2.5 G -四鏈體DNA識別T24表面靶物質的表征

與腫瘤細胞表面結合實驗表明，G4L1結合能力強于G4L2和G4L3，其可能原因之一是loop短的G4L1形成的平行結構更容易識別和結合腫瘤細胞，而loop長的G4L2和G4L2形成的混合平行結構識別和結合腫瘤細胞的能力較弱。而對于同一種G -四鏈體DNA與不同細胞的結合情況也不同，這一結果與以往的文獻報道相吻合[11]。分析其原因可能是G -四鏈體DNA識別細胞表面特定的靶蛋白，而不同細胞的表面特定靶蛋白的表達量不同，其表達越多，則與G -四鏈體DNA的結合越強。

為了確證G4L1識別和結合T24的靶標物質為細胞表面蛋白質，利用胰蛋白酶水解T24的表面膜蛋白后，與F-G4L1進行孵育，在4 ℃下用流式細胞術考察蛋白酶消化處理后的T24與F-G4L1的結合情況。以EDTA解離的細胞作為陽性對照組。如圖5所示，胰酶消化的T24與F-G4L1的結合(T24-G4L1-trypsin)遠少于EDTA解離的T24(T24-G4L1-EDTA)，說明G4L1可結合T24的表面膜蛋白。

圖5 G4L1與EDTA與胰蛋白酶消化后的T24結合的流式細胞術結果(A)和平均熒光強度(B)Fig.5 Histograms of flow cytometry of the binding of G4LI to T24 digested by EDTA or trypsin at 4 ℃(A) and their mean values of fluorescence intensity(B)

2.6 T24對G -四鏈體DNA內吞作用的激光共聚焦成像

圖6 F-DNA與T24在4 ℃(A)和37 ℃(B)下孵育的共聚焦成像Fig.6 Confocal images of T24 incubated with F-DNA at 4 ℃(A) and 37 ℃(B) for 30 minAll scale bars represent 20 μm.

為了研究不同loop長度的G -四鏈體DNA在T24中被受體介導內吞的情況，利用激光掃描共聚焦顯微成像技術考察不同溫度(4 ℃和37 ℃)下標記有熒光素的G -四鏈體DNA(F-G4L1、F-G4L2和F-G4L3)和對照序列(F-Ctr)在T24中的位置。如圖6所示，在4 ℃條件下，F-Ctr在細胞表面無熒光，而F-G4L1、F-G4L2和F-G4L3熒光分布在細胞膜表面，進一步證實了G -四鏈體DNA可與T24的表面膜蛋白結合；在37 ℃條件下，G4L1熒光大部分出現在細胞中，也出現在細胞膜上，熒光強度較強，而G4L2的熒光部分出現在細胞中，大部分出現在膜上，熒光強度較弱。這表明在4 ℃條件下，G -四鏈體DNA結合在腫瘤細胞膜蛋白上，在37 ℃條件下G -四鏈體DNA會被內吞進入腫瘤細胞，且loop長度短的G4L1更易被攝取。

對37 ℃下與G4L1結合的T24進行Z軸掃描并三維重構以得到細胞三維圖像。如圖7所示，從三維圖像可以直觀地看出G -四鏈體DNA被攝取進入細胞內；并且在X-Y平面上選取熒光點，該點在X-Z和Y-Z兩個平面都有熒光，進一步證實了G4L1被細胞攝取并進入細胞內。

圖7 37 ℃下G4L1進入細胞的共聚焦三維重構圖Fig.7 The 3D reconstruction images of confocal imaging of G4L1 internalized by T24 at 37 ℃

3 結論

本文采用圓二色光譜和凝膠電泳對不同連接環(loop)長度G -四鏈體DNA的結構和穩定性進行了研究，利用流式細胞術和激光共聚焦顯微技術考察了它們與不同腫瘤細胞的結合情況，研究了G -四鏈體DNA的連接環(loop)長度在其與腫瘤細胞結合中的作用。結果表明，loop長度越短的G -四鏈體DNA越易形成平行結構，識別和結合腫瘤細胞的能力越強，也更容易被細胞攝取；loop長度長的G -四鏈體DNA傾向于形成混合平行結構，這種結構的G -四鏈體DNA識別和結合腫瘤細胞的能力較弱。G -四鏈體loop長度與其形成的空間結構的對應關系，以及與細胞結合的普遍規律，對篩選或者高親和力、高特異性識別腫瘤細胞的含G -四鏈體結構的核酸適體，以及含G -四鏈體結構的靶向藥物遞送系統的設計和構建提供了參考和依據。