HPLC法測定不同煎劑中鉤藤堿和異鉤藤堿煎出效率

卓韋杰，侯擁铓，丁 悅，阿娜爾，付 磊，張語含，竇志榕，王 柳，孫 瑤，虞 梅

(烏魯木齊市中醫院南門醫院，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830000)

鉤藤，性甘涼，歸肝、心包經[1]。具有息風定驚，清熱平肝的功效。目前，臨床對于鉤藤飲片的應用主要為由高血壓引起的風眩以及神經性頭痛，是一味常用的中藥材。多見于配方使用，單味藥也可做茶飲[2]。鉤藤與它藥配伍成方后能夠增強息風止痙的作用從而發揮更好的療效，故臨床應用單味藥較少見，常見于方劑天麻鉤藤飲或半夏鉤藤湯中使用。2020年版《中國藥典》中明確規定，鉤藤入煎劑時應當“后下”煎煮，不可與它藥同煎太久或久煎[3]。現代藥理學研究證明鉤藤主要有效成分鉤藤堿與異鉤藤堿結構不穩定，久煎易被破環[6]。需要后下煎煮保證其有效成分能夠最大煎出并保留[4]。因此本文挑選了兩種臨床最常用的方劑(天麻鉤藤湯、半夏白術鉤藤飲)[5]進行鉤藤堿和異鉤藤堿的煎出效率研究，實驗結果報告如下。

1 實驗儀器及試藥

1.1 實驗儀器

美國Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀；電子分析天平(英衡C型號，浙江英衡實驗儀器有限公司)；超聲波提取器(CR-040S型，深圳春霖實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗用藥

鉤藤堿標準品(四川省維克奇生物科技有限公司；批號：wkq20060810 CAS：76-66-4)，異鉤藤堿標準品(四川省維克奇生物科技有限公司；批號：wkq21022607 CAS：6859-01-4)。分析純甲醇、色譜純甲醇、三乙胺水溶液。所有實驗用水均為滅菌注射用水，天麻鉤藤飲與半夏白術鉤藤方劑原藥材飲片(所有原藥材飲片均由烏魯木齊市中醫院藥學部鑒定合格)。

2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(4.6mm×200mm，5μm)；流動相：甲醇(色譜純)-水=68∶32(含0.2%三乙胺水溶液，冰乙酸調pH=7.0)，流速為0.8mL/min，檢測波長254nm，柱溫30℃。

3 實驗方法

3.1 對照品溶液的制備

精密稱定鉤藤堿對照品11.2mg、異鉤藤堿標準品3.2mg，分別置于兩只10mL的棕色容量瓶中，加入75%的分析純甲醇溶液定容至刻度線，搖勻，即得1.12mg/mL鉤藤堿標準品儲備液與0.32mg/mL得異鉤藤堿標準品儲備液，放置于低溫2～6℃下冷藏避光保存。

3.2 供試品溶液的制備

將稱取好的藥材用紗布包裹后加入5倍量水進行煎煮，至方中其他藥沸騰時將鉤藤后下煎煮，后下煎煮5分鐘時取為第一組，10分鐘時為第二組，此后每分鐘取為一組直至15分鐘。每種方劑共計7組。取得的煎劑經過濾補足后，取10mL用75%甲醇溶液定容至25mL容量瓶，常溫條件下超聲(功率300W)提取40min后用75%甲醇溶液再定容至刻度線，濾過后取續濾液，即得。

3.3 模型制劑的制備

模擬日常藥房調劑，按處方稱取天麻鉤藤飲與半夏白術鉤藤湯方組中各藥材7日用量，鉤藤單獨稱取，陰涼干燥環境下保存備用。

3.4 陰性模型的制備

按照上述方法稱取天麻鉤藤飲與半夏白術鉤藤湯方劑中各藥材飲片一日用量，不稱取鉤藤飲片，陰涼干燥環境下保存備用。

3.5 線性關系與系統專屬性的考察

精密吸取前文所述的配置完成的對照品溶液各2mL，均勻混合，得到鉤藤堿及異鉤藤堿對照品儲備液。按照0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL精密吸取6組儲備液，用75%甲醇稀釋定容至5mL即得。分別吸取上述6組稀釋液高效液相進樣10μL，色譜條件遵循色譜條件中規定的各項指標，測定峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標進行線性回歸，得出線性回歸方程Y鉤藤堿=0.9947X+4.2085(r2=0.9997)，證明鉤藤堿在0.0021～0.05mg范圍內有良好的線性關系。Y異鉤藤堿=0.9897X+0.2217(r2=0.9998)，證明異鉤藤堿在0.0023～0.0872mg范圍內有良好的線性關系。專屬性考察部分見圖1，混合標準品溶液、兩種方劑煎劑溶液的高效液相色譜圖證明峰形良好，兩種陰性模型煎劑高效液相色譜圖則說明在無鉤藤時，鉤藤堿及異鉤藤堿出峰處無其它雜質峰干擾結果，說明該色譜條件對兩種鉤藤堿的專屬性好，異鉤藤堿與鉤藤堿分離度均≥1.5，說明該色譜條件下得出的結果真實可靠。

4 方法學考察

4.1 精密度測定

精密吸取混合標準品儲備液10μL，按照色譜條件高效液相連續進樣6次，測定峰面積。計算RSD值為1.13%。

4.2 穩定性測定

取各供試品溶液在0h、2h、3h、4h、5h、6h分別測定鉤藤堿與異鉤藤堿峰面積，計算RSD值。天麻鉤藤飲中RSD鉤藤堿=2.11%，RSD異鉤藤堿=2.14%。半夏白術鉤藤湯中RSD鉤藤堿=2.71%，RSD異鉤藤堿=2.54%說明兩種方劑的供試品溶液在6h內均穩定。

4.3 含量測定

選取上文所述(3.2供試品溶液的配置)的各組配置完成的供試品溶液，按照色譜條件精密吸取10μL按照HPLC法進樣，通過峰面積與所得出的標準曲線方程(3.5線性關系與系統專屬性考察)計算兩種方劑中各不同時間的組份中鉤藤堿與異鉤藤堿含量。結果見圖2天麻鉤藤飲煎出效率時間規律圖、圖3半夏白術鉤藤湯煎出效率時間規律圖。

圖2 天麻鉤藤飲煎出效率時間規律圖

圖3 半夏白術鉤藤湯煎出效率時間規律圖

5 結果與討論

根據圖2天麻鉤藤飲煎出效率時間規律圖、圖3半夏白術鉤藤湯煎出效率時間規律圖。可以明顯看出，天麻鉤藤飲與半夏白術鉤藤湯在對鉤藤后下煎煮時，最佳煎煮時間并不一致，天麻鉤藤飲中鉤藤在11分鐘時，其中的鉤藤堿與異鉤藤堿的煎出效率最高，在之后開始下降，而在半夏天麻鉤藤飲中，鉤藤堿與異鉤藤堿的煎出效率在13分鐘時達到了最高，之后開始下降。這說明不同的方劑中，鉤藤飲片的煎煮時間并不一致。應當具體方劑具體對待，使中藥材鉤藤在臨床上獲得更好的療效。

在HPLC法對鉤藤堿和異鉤藤堿的考察中，曾經考察了以純水與甲醇的流動相適用性，分別考察了甲醇∶水=(67∶33、70∶30、65∶35、55∶45)，最終發現在68∶32時為鉤藤堿與異鉤藤堿的最小分離閾值，小于此比例者均未有效分離。即使如此，純水與甲醇流動相對于鉤藤堿與異鉤藤堿的分離度仍然小于1.5。因此，三乙胺水溶液在分離鉤藤堿與異鉤藤堿時至關重要，能夠有效分離二者的同時有效改善拖尾，使色譜條件穩定。而純水甲醇流動相不穩定，且易出現拖尾，粘連的現象。

本次實驗以兩種不同方組的方劑入手，具體以異鉤藤堿與鉤藤堿的煎出效率作為指標，得出了兩種不同的方劑的最佳煎煮時間。其中天麻鉤藤飲在鉤藤后下煎煮11分鐘時鉤藤堿與異鉤藤堿的煎出效率最高，半夏白術鉤藤湯中，鉤藤的最佳后下煎煮時間則為13分鐘，對臨床合理煎藥提供了參考。