幽門(mén)螺桿菌感染病兒胃黏膜組織微小RNA-497-3p表達(dá)及與Toll樣受體8/Toll樣受體10/核因子κB信號(hào)通路的相關(guān)性

彭丹，陳國(guó)強(qiáng)，董琳，陳霞

作者單位：1黃岡市中心醫(yī)院，a檢驗(yàn)科，b兒科，湖北 黃岡438000；2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院、襄陽(yáng)市中心醫(yī)院兒科，湖北 襄陽(yáng)441021

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染作為胃黏膜病變的主要致病因素，它能誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞的損傷，誘發(fā)胃炎、消化道潰瘍，并在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。近年來(lái)，兒童的HP感染陽(yáng)性率呈逐年上升趨勢(shì)，胃炎、胃潰瘍?cè)趦和械陌l(fā)病率也不斷升高。微小RNA（MicroRNAs，miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，它通過(guò)與特定mRNA 結(jié)合，影響轉(zhuǎn)錄過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞的生理過(guò)程。許多研究表明，微小RNA 是一種非常重要的調(diào)控因子，參與炎癥、癌癥等多種疾病的調(diào)控。JI 等MicroRNA-132 通過(guò)靶向HT-22 神經(jīng)細(xì)胞中的TRAF6，減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥損傷；Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）是一類(lèi)模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptor，PRRs），受病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）的刺激，產(chǎn)生抗原觸發(fā)的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。最近的研究表明，免疫細(xì)胞中的TLR 激活可誘導(dǎo)多種小的調(diào)控RNA，稱(chēng)為MicroRNAs，許多MicroRNA 可以通過(guò)積極或消極調(diào)節(jié)TLR 信號(hào)來(lái)控制炎癥過(guò)程和對(duì)感染的反應(yīng)。Garo 等研究顯示，異常的miR-155表達(dá)參與了多種免疫過(guò)程，包括多種自身免疫性疾病和癌癥的發(fā)病機(jī)制。然而，miR-497-3p在Hp感染病兒胃黏膜組織中的表達(dá)情況以及作用機(jī)制尚不清楚。鑒于此，本研究通過(guò)檢測(cè)miR-497-3p 在Hp 感染病兒胃黏膜組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平，探討其與核因子（NF）-κB 信號(hào)通路的相關(guān)性，以期為Hp感染致病機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年1月至2018 年11 月于黃岡市中心醫(yī)院就診的病兒210 例，其中男性120例，女性90例，年齡（10.54±3.21）歲，年齡范圍為4～14 歲。病兒經(jīng)組織病理Hp 染色和C 尿素呼氣試驗(yàn)檢查，將病兒分為Hp 感染組和Hp 非感染組。Hp感染組100 例，男58 例，女42 例，年齡（10.43±2.12）歲；Hp 非 感 染組110 例，男62 例，女48 例，年齡（10.25±2.56）歲，按其病因可分為飲食、藥物刺激和膽汁反流。兩組性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。入選標(biāo)準(zhǔn)：有反酸、嘔吐、腹部不適、惡心、黑便或嘔血癥狀，且近2 個(gè)月無(wú)鉍劑、抗菌藥物、離子泵阻滯劑、激素、質(zhì)子泵抑制劑使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：有心、肝、腎功能不全，營(yíng)養(yǎng)不良，感染病，免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能異常，惡性腫瘤。病兒及其監(jiān)護(hù)人知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑及儀器

RNA 提取試劑Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa 公司。miR-497-3p、Toll樣受體8（TLR8）、Toll 樣受體10（TLR10）、NF-κB mRNA 和內(nèi)參GAPDH 引物設(shè)計(jì)及合成皆由上海生工生物公司設(shè)計(jì)完成。熒光PCR 檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自BIO-RAD（美國(guó)）。腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）ELISA 試劑盒購(gòu)自Thermofisher 公司（美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 病兒行Hp 檢測(cè)及胃鏡檢查前需禁食6 h。Hp 檢測(cè)，病兒口服C 尿素膠囊，30 min行呼氣試驗(yàn)。采用紅外線能譜儀檢測(cè)標(biāo)本C 的原子峰值。病兒胃鏡檢查時(shí)，留取病兒胃竇部和胃黏膜組織置于-80 ℃冰箱用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn) 采用qRT-PCR 方法檢測(cè)胃黏膜組織中miR-497-3p、TLR8、TLR10 和NF-Kb mRNA 的 表 達(dá) 水 平。用TRIzol 提取組織中的總RNA，取1 000 ng 總RNA，按照TaKaRa 試劑盒的說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)為cDNA。以逆轉(zhuǎn)好的cDNA 為轉(zhuǎn)錄模板，qRT-PCR 試劑盒和引物為試劑，按以下PCR 轉(zhuǎn)錄條件：預(yù)變性95 ℃30 s一個(gè)外循環(huán)；PCR 反應(yīng)階段是40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95 ℃5 s 和60 ℃30 s 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果GAPDH 作 為 內(nèi) 參，采 用2法 計(jì) 算miR-497-3p、TLR8、TLR10和NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

miR-497-3p的引物序列為：

正向：5′-CAGCAGCACACUGUGGUUUGUA-3′

反向：5′-CAAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′

TLR8的引物序列為：

正向：5′-ATGTTCCTTCAGTCGTCAATGC-3′

反向：5′-TTGCTGCACTCTGCAATAACT-3′

TLR10的引物序列為：

正向：5′-GGTTCTTTTGCGTGATGGAATC-3′

反向：5′-GGTCGTCCCAGAGTAAATCAAC-3′

NF-Kb的引物序列為：

正向：5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′

反向：5′-CCATCACGCAAAAGAACCCAG-3′

GAPDH的引物序列為：

正向：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′

反向：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′

1.3.3

ELISA 實(shí)驗(yàn) ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病兒胃黏膜組織中的炎性因子的表達(dá)。將組織制備為勻漿，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)，離心提取上清液，檢測(cè)黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。觀測(cè)資料主要是計(jì)量數(shù)據(jù)，用x ± s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，變量間相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析，以P ＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-497-3p、TLR8、TLR10 和NF

-κ

B 表達(dá)水平比較

與Hp 非感染組比較，Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p水平下調(diào)，TLR8、TLR10和NFκB 水平均上調(diào)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 幽門(mén)螺桿菌（Hp）感染組與Hp非感染組胃黏膜組織中miR-497-3p、TLR8、TLR10和NF-Kb表達(dá)水平比較/x ± s

2.2 兩組TNF-

α

、IL-6 、IL

-

8 和IL

-

10 表達(dá)水平比較

與Hp 非感染組比較，Hp 感染組胃黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10 的水平均上調(diào)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 miRNA-497-3p 的表達(dá)水平用于診斷Hp 感染ROC 曲線

以Hp 感染組為陽(yáng)性樣本（n= 100），以Hp 非感染組為陰性樣本（n = 110），再將miRNA-497-3p 指標(biāo)水平劃分成7～8 個(gè)組段，建立接收者工作特征曲線（receiver operation characteristic，ROC）診斷分析模型。經(jīng)ROC 分析知：miRNA-497-3p 診斷Hp感染的ROC 曲線下面積（AUC）為0.926（標(biāo)準(zhǔn)誤0.023，95%CI：0.824～0.912）。取1.025 為診斷Hp感染的臨界值，其相應(yīng)的敏感度和特異度分別為91.8%和93.7%。

表2 幽門(mén)螺桿菌（Hp）感染組與Hp非感染組胃黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10表達(dá)水平比較/x ± s

圖1 胃黏膜組織中miR-497-3p的ROC曲線

2.4 相關(guān)性分析

Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p 分別與TLR8、TLR10、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10 的mRNA 水平呈 現(xiàn) 負(fù)相關(guān)性（r = -0.516，r=-0.492，r=-0.366，r=-0.342，r=-0.418，r=-0.406，r=-0.432，P ＜0.05）。

3 討論

Hp 是一級(jí)致癌因子，它與慢性胃炎、胃癌和消化性潰瘍等多種胃腸道疾病的發(fā)病密切相關(guān)。兒童是HP 感染的易感染人群，兒童感染Hp 后機(jī)體不能自然清除，不進(jìn)行治療將會(huì)處于終身持續(xù)感染狀態(tài)。有研究表明Hp 感染能引起胃黏膜組織中炎性因子的變化導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，Hp 感染組病兒胃黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10水平均高于Hp非感染組，說(shuō)明Hp感染病兒胃黏膜組織中炎性因子水平升高，可能是Hp 感染的一個(gè)致病因素。

MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為20～24 個(gè)核苷酸沒(méi)有編碼能力的微小RNA，在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用，是基因表達(dá)的基本調(diào)控機(jī)制。近年來(lái)，許多研究表明，miRNA 在人類(lèi)癌癥的發(fā)展、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和耐藥性中發(fā)揮重要作用。例如，miRNA 可以與信號(hào)通路相互作用，通過(guò)影響癌細(xì)胞遷移、侵襲、血管生成和增殖來(lái)調(diào)控腫瘤 轉(zhuǎn) 移。特 異 性miRNA 在Hp 感 染 組 織 中 表達(dá)，miRNAs 的異常表達(dá)在Hp 感染致病過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。研究顯示miR-24-3p 在胃黏膜病變?cè)缙诒磉_(dá)較高，Hp 能在胃黏膜損傷早期參與miR-24-3p 的調(diào)控，使miR-24-3p 在胃黏膜組織中的表達(dá)減少，導(dǎo)致胃黏膜病變加重。Xie 等研究發(fā)現(xiàn)miR-152 和miR-200b 靶向調(diào)控B7-H1 的表達(dá)促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。Li 等研究證明MicroRNA-187 通過(guò)抑制FOXA2，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p mRNA 表達(dá)量低于Hp 非感 染 組，說(shuō) 明miR-497-3p 可能參 與了Hp 感染的致病過(guò)程。

HP感染與慢性胃炎、胃癌和消化性潰瘍等多種胃腸道疾病的發(fā)病密切相關(guān)。經(jīng)Targetscan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-497-3p 的靶基因有TLR8、TLR10。而TLR8、TLR10 是Toll 樣受體家族成員，而Toll 樣受體家族是調(diào)控機(jī)體炎性反應(yīng)的重要通路，在促進(jìn)炎性反應(yīng)及多種炎性因子釋放中發(fā)揮重要作用。Young 等研究顯示miR-21 可作為T(mén)LR8 的內(nèi)源性配體，激活TRL8，促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)病。Hp可激活TLR10，促進(jìn)IL-8 和TNF 炎性因子的分泌。本研究結(jié)果顯示，Hp 感染組胃黏膜組織中TLR8、TLR10 和NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于Hp 非感染組，說(shuō)明TLR8/TLR10/NF-κB 信號(hào)通路可能參與Hp 感染致病過(guò)程。相關(guān)分析結(jié)果顯示，Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p 相對(duì)表達(dá)量與TLR8、TLR10 mRNA 和NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量，IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α 水平均呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明miR-497-3p 可能通過(guò)調(diào)控TLR8/TLR10/NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)而在Hp 感染致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，miR-497-3p在Hp感染病兒的胃黏膜組織中的異常低表達(dá)，其可能是通過(guò)影響TLR8/TLR10/NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，從而在Hp感染的致病過(guò)程中發(fā)揮作用，可為臨床下一步的治療提供思路。但是影響病兒Hp 感染的因素很多，其具體的發(fā)病機(jī)制及診斷尚需進(jìn)一步深入研究，且在接下來(lái)的工作中會(huì)重點(diǎn)探討miR-497-3p 影響病兒Hp感染具體的分子機(jī)制。