血腦屏障氧糖剝奪再灌體外模型小鼠腦內皮細胞bEnd.3中微小RNA-290b-3p的作用及機制研究

張奕雯，凡子蓮，李經倫，熊蘭，趙自勝，李超

作者單位：1廣元市第一人民醫院，a神經內科，b放射科，四川 廣元628000；

2西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川 瀘州646000

中風是最具破壞性的疾病之一，排名為全世界死亡的第二大原因。中風可分為缺血性中風和出血性中風。世界衛生組織（WHO）將中風定義為由腦血管病變導致的快速發展的腦功能局灶性或全局性紊亂的臨床癥狀，癥狀持續至少24 h，嚴重將導致死亡。缺血性中風的核心事件是大腦組織的血液供應中斷，進一步導致缺氧和營養物質缺乏并加劇腦損傷。多年來，缺血性中風過程中的病理機制如細胞凋亡、炎癥、氧化應激和腦水腫等得到深入研究。然而，目前對于缺血性中風的治療仍具有很大局限，缺乏具有特定功效的藥物。

血腦屏障破壞在缺血性中風誘導的腦損傷中起關鍵作用。缺血性中風引起的內皮功能障礙，增加微血管通透性，導致血腦屏障滲漏，隨后引起腦水腫和出血性轉化，并促進炎癥反應，從而加重腦損傷。因此，在缺血期間保持血腦屏障完整性對中風管理具有重要意義并且需要進一步研究。最近的研究表明微小RNA（miRNA）可以調節各種中風危險因素和疾病前期機制，促進或抑制miRNA 的表達可能有益于中風后恢復。有關miRNA 在中風后血腦屏障破壞的作用及機制尚不清楚。

本研究自2019 年3 月采用體外培養的小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3 細胞，氧糖剝奪再灌模型（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模擬體內腦中風損傷，通過檢測miR-290b-3p 的表達以及抑制miR-290b-3p 對體外血腦屏障模型通透性的影響，探討miR-290b-3p 在體外氧糖剝奪模型下血腦屏障破壞的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3（ATCC 細胞庫），DMEM/F12 培養基（Sigma），胎牛血清（FBS）（杭州四季青），緊密連接蛋白5（Claudin-5）抗體（Proteintech），miR-290b-3p 特異性引物（（Ribo-Bio），miR-290b-3p抑制劑（吉瑪基因）。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養 小鼠腦內皮細胞系bEnd.3 在37 ℃細胞恒溫箱中孵育，DMEM/F12 補充有10%（V/V）的FBS，青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）。小鼠腦微血管內皮bEnd.3 細胞在4～10 次傳代后用于實驗。

1.2.2

體外血腦屏障 bEnd.3 以2.5×10的密度接種到Transwell 小室內腔（0.4 μm 孔徑）。使細胞生長5 d 以實現匯合。為了評估細胞旁通透性，將熒光素異硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（70 kDa；Sigma-Aldrich）以1 μmol/L 的濃度添加到腔室中。在OGD 后1、2、3、4、6 h，使用來自下腔（外）室的30 μL 培養基，用熒光讀數器測量熒光強度，其中在每次測量前30 min 用新鮮培養基替換原培養基。樣品中示蹤劑的濃度由使用已知濃度的示蹤劑擬合的標準曲線計算。確定示蹤劑從上腔室到下腔室的擴散速率，表示為pmol·mm·min。

1.2.3

OGD/R 為了在體外模擬缺血，提前將bEnd.3細胞鋪板，接種到24孔板中。先吸去正常培養基，用PBS 清洗細胞兩次，加入無糖DMEM 培養基，24 孔板放入厭氧罐中。將厭氧罐放入恒溫（37 ℃）細胞培養箱中，對細胞進行缺糖、缺氧損傷。1 h 后復灌，換成正常培養基，放入恒溫細胞培養箱中分別培養至設定時間參數，以供血腦屏障研究觀測使用。

1.2.4

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）測定 首先，使用TRIzol 試劑提取總RNA。然后，使用用于qPCR試劑盒（R133-01，Vazyme Biotech）逆轉錄miRNA-290b-3p。接下來，進行實時熒光定量PCR檢測成熟miR-290b-3p的表達。

1.2.5

蛋白質印跡法（Western Blot） 在冰上使用細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白。4 ℃，12 000 g離心20 min。BCA 蛋白定量。12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上。用TBST 洗滌PVDF 膜3 次，每次15 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗（claudin-5，1∶1 000），4 ℃過夜。用TBST 洗3 次，每次15 min。室溫孵育二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗，1∶2 000）2 h。用TBST 洗3 次，每次15 min。用化學發光顯色法顯影，拍照統計。

1.2.6

熒光素酶基因報告實驗 根據Targetscan 軟件預測miR-290b-3p 與Claudin-5 mRNA 3’-UTR 區結合序列。將含該結合位點的片段插入到熒光素酶報告基因質粒。構建兩組質粒：包含該結合位點的野生型質粒（Claudin-5 3’UTR WT）以及突變該結合位點的突變質粒（Claudin-5 3’UTR Mut）。轉染bEnd.3 細胞miR-290b-3p（Robbio）和兩組質粒，摩爾比為50∶1。miRNA 對照用作陰性對照。轉染后24 h 按照制造商的方案（Promega，E2920）進行測定熒光素酶活性測定。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS 17.0 軟件包進行分析。觀測資料主要為計量數據，均通過正態性檢驗。以x ± s 描述，兩組比較采用兩獨立樣本t 檢驗或校正t 檢驗。多時點資料比較為重復測量方差分析+組間LSD-t 檢驗+組內差值t 檢驗。趨勢分析為計量資料行兩分類轉化后的Cochran Armitage 趨勢檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外OGD/R 模型下血腦屏障通透性增加

構建體外血腦屏障模型，見圖1。在OGD/R 后，血腦屏障在4 h 和6 h 遭到破壞，對FITC-葡聚糖通透性明顯增加，與對照組及與1 h 比較，各時間點FITC-葡聚糖（70 kDa）血腦屏障通透量均差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 OGD/R后各時間點FITC-葡聚糖（70 kDa）血腦屏障通透性比較/（pmol·mm-2·min-1，x ± s）

此外，再以OGD/R 組FITC-葡聚糖（70 kDa）數據的總均值為界值，將OGD/R 組每個樣本轉化成兩分類計數資料，行Cochran Armitage 趨勢檢驗，結果提示其通透性有隨時間增加的趨勢（χ=25.046，P ＜0.05）。

圖1 構建體外血腦屏障模型

2.2 OGD/R 后miR

-

290b

-

3p 表達增加

在OGD/R后，小鼠腦內皮細胞bEnd.3 中miR-290b-3p 表達呈時間依賴性升高。與對照組及與1 h 比較，各時間點miR-290b-3p 表達量均差異有統計學意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 OGD/R 后各時間點miR-290b-3p表達量比較/x ± s

2.3 miR-290b-3p與Claudin-5 mRNA 結合

利用miRNA 靶基因預測軟件Targetscan 預測出miR-290b-3p與Claudin-5直接結合，見圖2。熒光素酶實驗miR-290b-3p與Clauldin-5 的結合，結果見表3。

2.4 敲低miR-290b-3p 緩解OGD/R 后血腦屏障的破壞

抑制OGD/R 后miR-290b-3p 的表達可以改善bEnd.3細胞OGD/R后Claudin-5的降低現象，并且抑制mi-290b-3p 的表達可降低體外血腦屏障模型對FITC-葡聚糖的通透性。結果圖3。

表3 miR-290b-3p與claudin-5結合數據/（n=6，x ± s）

圖2 miRNA靶基因預測軟件Targetscan預測miR-290b-3p與Claudin-5直接結合結果

圖3 敲低miR-290b-3p緩解OGD/R后血腦屏障破壞的條帶圖

3 討論

血腦屏障在維持中樞神經系統穩定中發揮重要作用，其可以將神經系統與外周免疫系統分開，防止大腦受到有毒物質的影響；同時，血腦屏障可以阻礙大分子物質進入腦內。在缺血性腦損傷中，血腦屏障的通透性完整性遭到破壞，并誘導腦水腫，加重腦損傷。因此探究缺血性中風后血腦屏障的損傷機制具有重要意義。

本研究發現OGD/R 后體外血腦屏障模型的通透性增加，并伴隨著miR-290b-3p 的表達增加。miRNA 是長度約22 個核苷酸的單鏈非編碼RNA 分子，其通過與mRNA 分子的3′非翻譯區（UTR）結合并使促進mRNA 降解或抑制它們的翻譯而充當基因表達的調節劑。miRNA分析技術（微陣列分析）在缺血性腦損傷中的應用始于2008 年。研究發現miRNA 對腦缺血中下游靶基因具有潛在調節作用，從而在缺血性腦損傷中發揮重要作用。

Claudin-5 是血腦屏障中的緊密連接蛋白。大量研究表明，Claudin-5 可調節血腦屏障的完整性和通透性。并且Claudin-5表達的增加在神經系統疾病中起著神經保護作用，特別是在腦缺血性中風中。此外，Claudin-5 可能是缺血性中風早期出血性轉化檢測的潛在標志物。介于Claudin-5在維持血腦屏障完整性和通透性中的重要作用，目前開發出藥物治療，激素治療，受體靶向，基因治療和物理治療等治療方法，旨在通過Claudin-5 調節血腦屏障達到治療缺血性中風的目的。這些證據表明，Claudin-5 在缺血性中風中對維持BBB 完整性起著重要作用。在缺血性腦中風后，Claudin-5 的表達降低，這會導致BBB 的破壞，導致腦損傷加劇。然而，目前許多問題仍未得到解決。例如，中風后Claudin-5 表達降低的機制是什么？雖然前期有研究發現基質金屬酶（MMP）可介導腦缺血后大鼠血腦屏障中claudin-5的破壞，但是腦中風后Claudin-5 的破壞是否涉及其他機制仍需繼續研究。鑒于miRNA 在基因表達中調控作用，本研究通過miRNA靶基因預測及熒光素酶報告實驗發現miR-290b-3p直接靶向Claudin-5。本研究發現miR-290b-3p 對Claudin-5 具有調節作用，下調OGD/R 后miR-290b-3p 的水平，Claudin-5 的表達增加，并且體外血腦屏障模型對FITC-葡聚糖的通透性降低，這表明下調miR-290b-3p 可促進Claudin-5 的表達從而發揮血腦屏障保護作用。

本研究結果表明，小鼠腦內皮細胞bEnd3 中miR-290b-3p 在OGD/R 后表達增加，這會增加miR-290b-3p 與Claudin-5 mRNA 的結合，促進Claudin-5 mRNA 的降解，這可能是Claudin-5 在OGD/R 后降低的原因之一。因此抑制OGD/R 后miR-290b-3p表達上調可通過增加Claudin-5 的表達來保護BBB 完整性。綜上，miR-290b-3p 可能作為預防中風后BBB破壞的治療靶點。