尿液及血清骨膜蛋白的檢測對早期診斷兒童紫癜性腎炎的價值

王麗，周小勤，涂丹娜，黃方，陳霞

作者單位：1湖北省婦幼保健院兒內科，湖北 武漢430070；

2湖北文理學院附屬醫院、襄陽市中心醫院兒科，湖北 襄陽441021

過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是發生在兒童中一種免疫球蛋白A（IgA）介導的系統性小血管炎，IgA 抗體在血管壁上的沉積會導致皮膚、關節、腸和腎臟的癥狀。紫癜性腎炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是HSP 最嚴重的并發癥之一，通常定義為HSP伴有血尿和/或蛋白尿的腎臟受累，并且通常決定HSP病人的預后，相關研究結果顯示HSPN 在兒童繼發性腎小球疾病中占第一位。骨膜蛋白是一種細胞外基質蛋白，是由成骨細胞及其前體細胞分泌的，多在牙周韌帶和骨膜中出現，與皮膚修復、牙齒與骨骼生長有關。近年研究顯示，骨膜蛋白在一些腎病中有表達，其在HSPN 中的作用研究較少。本研究通過檢測HSPN 病兒尿液與血清中骨膜蛋白的表達水平，探討骨膜蛋白的檢測對早期診斷兒童HSPN的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012 年6 月至2018 年6 月在湖北省婦幼保健院就診的HSPN 病兒35 例為HSPN組，其中男性19 例，女性16 例，年齡（8.62±1.68）歲，年齡范圍為6～11 歲。納入的HSPN 病兒均符合兒童HSPN 診治循證指南（2016 年由中華醫學會兒科學分會腎臟學組制定）。選取同期在湖北省婦幼保健院門診健康體檢的35例兒童為健康對照組，其中男性19 例，女性16 例，年齡（8.38±1.72）歲，年齡范圍為6～11 歲。納入標準：①近1 個月未服用存在腎毒性藥物；②既往無泌尿系統及腎臟疾病，尿檢篩查正常，家族無腎臟遺傳性疾病。兩組年齡比較，差異無統計學意義（t=1.629，P=0.072），具有可比性。病兒近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 樣本采集

HSPN 組病兒在就診第二天早晨采集尿液和血液樣本，健康對照組兒童于體檢時留取尿液和血液樣本。具體方法：在清洗外陰后采集中斷尿5 mL 作為尿液樣本，采集外周靜脈血3 mL 作為血液樣本，并在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min。分別吸取上層尿液及上層血清至無菌干燥的EP 管中，將所得樣本分別編號后置于-80 ℃冰箱中凍存備用。

1.3 骨膜蛋白的測定

1.3.1

實驗材料與器材 人骨膜蛋白試劑盒（購自江蘇酶標生物科技有限公司），酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司），振蕩器（匯誠生物科技有限公司）。

1.3.2

實驗方法 采用ELISA法檢測血清和尿的樣品中骨膜蛋白的相對表達水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。（1）實驗前準備：試劑盒、血清和尿的樣品均置于室溫中復溫，以備后續實驗使用。（2）實驗過程：①將標準品倍比稀釋后繪制標準曲線。將50 μL標準品和待測樣品分別加入反應孔中，蓋上膜蓋后輕輕振蕩，37 ℃孵育30 min。②棄去孔內液體，加入配制好的洗滌液，洗滌5次并拍干。③除空白孔之外的反應孔中加入酶標試劑50 μL。孵育、洗滌同前。④每孔加入A、B 顯色劑各50 μL，輕輕混勻，37 ℃孵育10 min，避免光照。迅速加入50 μL 終止液。⑤在450 nm 波長處測定各孔的OD 值。（3）計算方法：根據樣品的OD 值在標準曲線中查出相應的濃度，再乘以稀釋的倍數，計算出樣品中人骨膜蛋白的實際濃度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料用x ± s 表示，比較采用t 檢驗，采用Medcalc 軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線）并進行分析，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組尿液及血清骨膜蛋白表達水平比較

兩組尿液及血清中骨膜蛋白表達水平均差異有統計學意義（P ＜0.01）。見表1。

表1 健康對照組與紫癜性腎炎（HSPN）組尿液及血清中骨膜蛋白表達水平比較/（pg/mL，±s）

2.2 尿液及血清骨膜蛋白ROC 曲線

為了評價尿液及血清骨膜蛋白對兒童HSPN 早期診斷的價值，本研究通過繪制ROC 曲線進行分析，結果顯示曲線下面積（AUC）分別為0.838 與0.778，病兒尿液中骨膜蛋白表達水平的靈敏度和特異度相對較好，尿液及血清骨膜蛋白對兒童HSPN 早期診斷的價值差異有統計學意義（Z=6.528，P ＜0.01）。見圖1和表2。

圖1 尿液及血清骨膜蛋白ROC曲線

表2 尿液及血清骨膜蛋白對兒童紫癜性腎炎（HSPN）早期診斷的ROC分析

3 討論

HSP是一種小血管、白細胞碎裂性血管炎，可在不同器官中引起多種癥狀。HSP是兒童時期最常見的系統性血管炎之一，男孩的發病率略高于女孩，有研究顯示17 歲以下兒童HSP 患病率為6～24/10萬，而HSPN 通常為HSP 伴有血尿和/或蛋白尿的腎臟受累。大約20%的HSPN 病人發展為腎病或腎病綜合征，基于大量臨床和實驗研究的結果顯示，在HSPN 腎小球中腎外來源的含IgA 免疫復合物的腎小球沉積可導致腎臟炎癥改變，因此，HSPN 可被視為免疫復合物腎炎。骨膜蛋白作為由成骨細胞及其前體細胞分泌的一種細胞外基質蛋白，多在牙周韌帶和骨膜中出現，并參與皮膚修復、牙齒與骨骼生長。近年來，有關骨膜蛋白在腎臟中的作用得到了研究人員的重視，Hwang等的研究結果顯示，在IgA 腎病腎纖維化病人尿中骨膜蛋白可能是早期生物標志物。有研究顯示在狼瘡性腎炎病人中，骨膜蛋白主要表達于腎小球周圍發生纖維化的部位與硬化的腎小球中。在糖尿病腎病病人的腎小管和腎小球中骨膜蛋白均有表達，結果顯示腎功能與骨膜蛋白表達量相關。本研究結果顯示：HSPN組尿液及血清中骨膜蛋白的表達量均高于健康對照組，推測在HSPN 的發生發展過程中骨膜蛋白可能參與其中，當機體發生炎癥免疫反應時，刺激纖維化的腎組織及腎血管平滑肌細胞產生骨膜蛋白并釋放入血；而過敏性紫癜病兒發生腎損傷時，受損的腎組織被誘導表達骨膜蛋白，骨膜蛋白通過腎小管上皮細胞分泌或表達骨膜蛋白的細胞退化脫落至尿液中導致尿骨膜蛋白增加。本研究通過繪制ROC曲線進行分析，曲線下面積（AUC）分別為0.838與0.778，尿液及血清骨膜蛋白對兒童HSPN 早期診斷的價值差異有統計學意義，病兒尿液中骨膜蛋白表達水平的靈敏度和特異度相對較好，提示我們在HSPN的相關研究中尿骨膜蛋白可作為敏感指標。