超高效液相色譜法測定化妝品中15種防曬劑含量

李祥勝，高家敏

作者單位：1安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院化妝品室，安徽 合肥230051；

2中國食品藥品檢定研究院化妝品所，北京100050

紫外線輻射對人類的健康有很多的不利影響。地球表面的紫外線由90%以上UVA（320～400 nm）和10%以下的UVB（290～320 nm）構(gòu)成。UVA 能穿透真皮，使其產(chǎn)生黑色素，形成曬黑，UVB 則能穿過角質(zhì)層，引起皮膚傷害，出現(xiàn)紅斑。防曬劑在一定程度上對皮膚起到了保護(hù)作用，一般分為物理防曬劑和化學(xué)防曬劑，其中化學(xué)性防曬劑具有較高紫外線吸收性能的優(yōu)點(diǎn)。各類防曬劑對人體的安全性并不一樣，如使用過量可能會引起皮膚過敏反應(yīng)和刺激反應(yīng)，因此，國際和國內(nèi)對化學(xué)防曬劑的使用種類和使用量都有嚴(yán)格的管理和限制，我國的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）對其中的25種化學(xué)防曬劑進(jìn)行了明確的限量，并采用高效液相色譜（HPLC）法對其中的苯基苯并咪唑磺酸等15 種防曬劑進(jìn)行含量測定，但該方法在實(shí)際的檢測中存在一定局限性，使用原梯度條件洗脫，無法將色譜峰完全分開，且使用原供試品溶液制備方法，無法很好地同時對15種組分進(jìn)行充分溶解提取，導(dǎo)致不能準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量分析。本研究自2019年1—4月在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過試驗(yàn)采用超高效液相色譜（UPLC）法進(jìn)一步完善和優(yōu)化了該方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AcQuity UPLC，PDA 檢測器（Waters，美國）；XP205 型電子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；超聲清洗儀（Elma，德國）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國）。甲醇、四氫呋喃均為色譜純；高氯酸為分析純；15 種防曬劑標(biāo)準(zhǔn)品：苯基苯并咪唑磺酸（批號G01234，純度99.9%，USP REFERENCE STANDARD）、二苯酮-4（批號20104，純度99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、對氨基苯甲酸（批號40717，純度99.9%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、二苯酮-3（批號14971，純度100%，AccuStandard）、對甲氧基肉桂酸異戊酯（批號H1860050，純度98.0%，ANPEL）、4-甲基芐亞基樟腦（批號90217，純度99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、PABA 乙基己酯（批號H1E172，純度99.2%，USP REFERENCE STANDARD）、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷（批號H0G220，純 度99.5%，USP REFERENCE STANDARD）、奧克立林（批號90701，純度98.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、甲氧基肉桂酸乙基己酯（批號40916，純度99.6%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、水楊酸乙基己酯（批號G0D278，純度99.5%，USP REFERENCE STANDARD）、胡莫柳酯（批號H0D322，純度99.4%，USP REFERENCE STANDARD）、乙基己基三嗪酮（批號F0H178，純度99.5%，USP REFERENCE STANDARD）、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚（批號F0F222，純度99.8%，USP REFERENCE STANDARD）、雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪（批號F0G275，純度98.7%，USP REFERENCE STANDARD）；混合溶液［V（甲醇）∶V（四氫呋喃）∶V（水）∶V（高氯酸）=250∶450∶300∶0.2］。

1.2 溶液的配制

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取上述15 種標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于10 mL 棕色量瓶中，前7 種標(biāo)準(zhǔn)品先加混合溶液適量（苯基苯并咪唑磺酸先滴加1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 使其溶解），超聲使溶解并用混合溶液稀釋至刻度，搖勻，作為各單標(biāo)儲備液；后8種標(biāo)準(zhǔn)品先加四氫呋喃適量，超聲使溶解并用四氫呋喃稀釋至刻度，搖勻，作為各單標(biāo)儲備液。精密量取各單標(biāo)儲備液適量，置50 mL量瓶中，用混合溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液A；精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液A 1.0 mL，置10 mL 量瓶中，用混合溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液B。

1.2.2 樣品處理 稱取樣品約0.25 g，精密稱定，置于25 mL離心管中，加入四氫呋喃5 mL，渦旋使樣品溶散，加入上述混合溶液，定容，混勻，超聲振蕩30 min，精密量取提取液1.0 mL，再用混合溶液稀釋至10.0 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：CORTECSUPLCC18（1.6 μm ，2.1 mm×150 mm）；檢測波長：311 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL/min；流動相：A 為φ（甲酸）=0.1%，B 為V（甲醇）∶V（乙醇）=3∶1；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）色譜條件，苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮-4、對氨基苯甲酸三種成分的色譜峰保留時間過短、分離度差，且二苯酮-4/二苯酮-5 色譜峰拖尾，在檢測中極易受到樣品雜質(zhì)峰的干擾，在實(shí)際檢測中如果改變洗脫程序延緩上述三種成分的出峰時間以提高其分離度，會導(dǎo)致后面成分的出峰時間過長，不利于工作效率的提高；四氫呋喃和高氯酸對色譜系統(tǒng)管路有較強(qiáng)的腐蝕性。本研究通過使用UPLC 法，改變流動相組分，進(jìn)行梯度洗脫，15 種防曬劑組分的色譜峰均得到了很好的分離，色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，且在實(shí)際檢測樣品過程中，儀器連續(xù)運(yùn)行一周，15 種防曬劑組分保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～0.6%，可充分滿足大批量樣品檢測的要求；相比HPLC 法節(jié)約了80%的流動相，降低了有機(jī)溶劑的消耗、節(jié)能環(huán)保（圖1）。

2.2 供試品溶液制備方法優(yōu)化

由于15 種防曬劑的極性存在較大差異，參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）樣品處理第一法（不含蠟質(zhì)的樣品）制備供試品溶液時發(fā)現(xiàn)，使用上述混合溶液分散溶解供試品時，極性小的待測組分提取效率較差，導(dǎo)致極性小的待測組分測定結(jié)果偏低甚至造成假陰性；而當(dāng)參照樣品處理第二法（含蠟質(zhì)的樣品）制備供試品溶液時發(fā)現(xiàn)，使用四氫呋喃分散溶解供試品時，極性大的待測組分提取效率較差，也易導(dǎo)致極性大的待測組分測定結(jié)果偏低甚至造成假陰性；綜合上述結(jié)果，本文采用先加入適量四氫呋喃渦旋使樣品溶散，再加入上述混合溶液，超聲振蕩制備供試品溶液，結(jié)果顯示該法能同時滿足對15種防曬劑組分的充分溶解提取。

2.3 線性關(guān)系及檢出限

精密量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液B 稀釋制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述“1.3”試驗(yàn)條件下，精密量取1 μL 分別注入UPLC，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3 倍信噪比計算檢出限；各成分線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均不小于0.999；線性范圍較寬，可滿足實(shí)際工作中不同濃度樣品測定的要求；檢出限為0.000 7%～0.02%，均滿足《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）檢出限的要求（表2）。

2.4 精密度及溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“1.2.1”中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液B 1.0 μL，照上述的試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄各組分的峰面積，計算RSD；同時取此溶液每隔6 小時進(jìn)樣測定，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好，溶液中各組分在1周內(nèi)均穩(wěn)定。

2.5 回收率的測定

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，向空白基質(zhì)中加入各防曬劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按樣品前處理方法進(jìn)行處理，用上述的各標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回收率，各成分回收率為93.9%～104.2%，均可滿足測定準(zhǔn)確度的要求（表3）。

2.6 檢出防曬劑統(tǒng)計

用本研究建立的UPLC色譜法對市售70批防曬劑樣品進(jìn)行了含量測定分析，除去兩批物理防曬劑樣品中未檢出上述15 種防曬劑成分外，其余68批樣品中檢出1至6種不同防曬劑，均符合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）的限度規(guī)定，防曬劑總含量從3.4%至24.7%不等，但目前沒有相關(guān)法規(guī)對防曬劑總量進(jìn)行控制；68 批樣品中15 種防曬劑成分檢出頻次也不盡相同，其中對氨基苯甲酸、二苯酮-4、PABA 乙基己酯三種均未檢出，有57批樣品中檢出甲氧基肉桂酸乙基己酯，頻次最高，具體檢出頻次為檢出甲氧基肉桂酸乙基己酯57次，丁基甲氧基二苯酰基甲烷及雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪24 次，乙基己基三嗪酮及亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚21 次，水楊酸乙基己酯20次，奧克立林19次，二苯酮-3 17次，4-甲基芐亞基樟腦15次，苯基苯并咪唑磺酸12次，胡莫柳酯5次，對甲氧基肉桂酸異戊酯3次，未檢出對氨基苯甲酸、二苯酮-4及PABA乙基己酯。

圖1 15種防曬劑色譜圖

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

表3 回收率測定結(jié)果

3 討論

本方法在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）苯基苯并咪唑磺酸等15種組分的檢測方法基礎(chǔ)上，對樣品的前處理進(jìn)行了一定的優(yōu)化，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；通過將HPLC 法改為UPLC 法，使得15種防曬劑實(shí)現(xiàn)基線分離，提高了定量的準(zhǔn)確性，同時也大量減少有機(jī)溶劑的使用；對流動相組分進(jìn)行調(diào)整，替換了原來流動相中易爆、強(qiáng)腐蝕性的高氯酸和四氫呋喃，減少對超高效液相色譜儀管路系統(tǒng)的腐蝕和對環(huán)境的污染。回收率、精密度及溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)均表明本方法用于化妝品中15 種防曬劑的測定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。