慢性丙型肝炎患者載脂蛋白L1基因突變檢測

（青海省第四人民醫院檢驗科，西寧 810000）

丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）為單股正鏈RNA病毒，是引起機體發生肝炎的主要病原體[1]。丙型肝炎的嚴重程度從持續幾周以內的輕微病癥到慢性嚴重疾病不等。載脂蛋白（apoprotein，Ape）L1是參與機體脂蛋白的代謝和膽固醇平衡的調節，影響機體血脂濃度[2]。本研究探討慢性丙型肝炎患者ApeL1基因突變的檢測，以明確兩者的相關性。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年8月－2019年5月在我院感染科門診就診的慢性丙型肝炎患者78例作為HCV組，同期選擇健康人78例作為健康組。HCV組，男40例，女38例，年齡（45.20±4.20）歲，體質量指數（22.21±1.48）kg·m-2,白蛋白（88.29±2.19）g·L-1，血小板計數（178.20±23.09）×109·L-1；健康組，男39例，女39例，年齡（45.11±3.89）歲，體質量指數（21.18±2.19）kg·m-2，白蛋白（89.10±1.94）g·L-1，血小板計數（180.03±21.87）×109·L-1。2組入選者性別、年齡、體質量指數、白蛋白、血小板計數等比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入與排除標準

HCV組，均為初治患者，慢性丙型肝炎診斷符合我國《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》；患者簽署知情同意書。排除標準：自身免疫性疾病等患者；酒精性肝病患者；合并艾滋病患者；臨床資料缺乏者。健康組，無肝炎病史；血生化結果檢測正常。研究方案經醫院倫理委員會審批。

1.3 基因突變檢測

采集2組患者的靜脈血采集靜脈血5mL，抗后-70℃保存。提取全血組織的DNA，取稀釋后2μL提取后的DNA，紫外分光光度計檢測樣品純度的吸光度OD260/280nm需要在1.8～2.0，DNA濃度在100ng·pl-1以上。運用Bio-edit5.00軟件對ApeL1基因序列進行引物設計（由上海生工公司合成），擴增ApeL1基因全序列（包含2個外顯子和2個非編碼區）。擴增片段：ApeL1-1-F：ACTCAGCTTTGTGGGAGCAT，ApeL1-1-R：AGGCTCCTTTTCACCCAGAT，ApeL1-2-F：TGCCCTTACCTCACAAAACC，ApeL1-2-R：AGGTTCTGCTGCCTCTTCAA，ApeL1-3-F：CAGCCTGTGTTTCATCTCCA，ApeL1-3-R：AATCACACACGTTGCAGGAA。PCR反 應 體 系：2×TaqPCRStarMix12.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，加ddH20至25μL，擴增循環數為40個循環，對擴增產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。ApeL1基因的測序反應在ABI3700測序儀上完成，選用NCBI網站和SequenceScanner軟件進行比對分析，明確相應位點的突變情況。

1.4 統計學方法

選擇SPSS22.00軟件對本研究所有數據進行分析與處理，計量數據以均數±標準差（±s）表示，計數數據以百分比表示，對比采用t檢驗與χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組肝功能指標比較

HCV組HCVRNA水平為（8.24±0.55）lgIU·mL-1。見表1。

表1 2組肝功能指標比較（±s，n= 78）

表1 2組肝功能指標比較（±s，n= 78）

注：與健康組比較，# P＜0.05

組別 ALT/（U·L-1） AST/（U·L-1）HCV 組 89.20±4.20# 90.77±3.19#健康組 32.10±4.22 29.88±5.22

2.2 2組ApeL1基因突變率比較

見表2。

表2 2組ApeL1基因突變率比較（n = 78） 例

2.3 2組ApeL1基因突變類型的分布情況

見表3。

表3 2組ApeL1基因突變類型的分布情況（n = 78） 例

2.4 HCV組ApeL1基因突變與臨床特征的相關性

在HCV組中，Pearson相關分析顯示ApeL1基因突變與HCVRNA、ALT與AST水平都呈現相關性（P＜0.05）。見表4。

表4 HCV組ApeL1基因突變與臨床特征的相關性（n = 78）

3 討論

丙型肝炎是由HCV感染肝臟引起的一種急性或慢性肝病，目前全世界約有1.8億HCV感染者，我國的感染總人口超過5千萬[3]。HCV可分為多種基因型與基因亞型，其中ApeL1亞型與更嚴重的肝病相關，其涉及到肝癌的發展，具有強烈的藥物抵抗性并且很難治療[4]。本研究顯示，HCV組中ApeL1基因突變率為16.7%，顯著高于健康組的1.3%（P＜0.05）；在HCV組13例ApeL1基因突變患者中，-51G＞A7例，-26A＞G3例，310G＞A2例，895G＞T1例；健康組1例基因突變為310G＞A。ApeL1在介導和調節多種脂代謝中均起關鍵作用，通過多種途徑影響肝炎的形成。其靈敏度和特異性均優于作為常規指標的ALT和AST[5]。ApeL1在基因位于第19號染色體長臂上，基因突變可使得聚合酶的活性增強，從而增強HCVRNA合成，增強HCV的復制[6-7]。但不同的ApeL1突變位點其患病率有地區差異性，可能也有其他因素對突變部位產生影響，如壞境、年齡等。

研究顯示，遺傳背景在HCV發病中起重要作用，常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳是慢性丙型肝炎的主要遺傳方式，有學者通過混合連鎖不平衡繪圖鑒定出染色體19q13.1區域ApeL1的突變率比較高[8-9]。慢性丙型肝炎遺傳方式復雜多樣，其中30%為常染色體顯性遺傳，20%為常染色體隱性遺傳，15%為X連鎖遺傳。大多數的患者為單基因遺傳，但也存在二基因-雙等位基因和二基因-三等位基因遺傳方式。HCV是丙肝和肝癌的主要危險因素，HCV入侵的第1步是病毒與宿主細胞相互作用并且對于傳播和持續感染是必須的，研究[10-11]已經表明ApeL1是在感染宿主細胞過程中起到重要作用的蛋白。本研究Pearson相關分析也顯示HCV患者的ApeL1基因突變與HCVRNA、ALT與AST水平都呈現相關性。不過本研究樣本量較小，納入的研究指標比較少，沒有進行隨訪分析，沒有發現新的突變位點，將在后續研究中深入分析。

綜上所述，慢性丙型肝炎患者ApeL1基因突變比較常見，多為-51G＞A突變，與患者的肝功能與HCVRNA水平顯著相關。