類器官組織在感染性疾病研究中的應用

張舒心，蔡啟良，朱彩霞

復旦大學上海醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學系，醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點實驗室，上海 200032

隨著人類疾病譜的改變[1-2]，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)與肝癌[3](hepatitis B virus-associated carcinoma)、幽門螺桿菌與胃癌[4](helicobacter pylori-associated gastric cancer)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus, EBV)與淋巴瘤[5](Epstein-Barr virus-associated lymphoma)以及卡波西肉瘤相關(guān)病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)與卡波西肉瘤[6](Kaposi’s sarcoma)等慢性感染相關(guān)腫瘤的發(fā)生，逐漸成為全球人類健康的重要威脅因素。但是，國內(nèi)外對于腫瘤的研究一直缺乏有效的體外研究模型[7]，更是缺乏針對病原體感染所引發(fā)腫瘤的模型。類器官(organoid)作為一種新型的體外三維(three dimensions，3D)技術(shù)培養(yǎng)的組織器官模型，無疑為這一領(lǐng)域的研究拓寬了思路。類器官不僅能夠高度模擬原位組織在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能，在基因水平上維持其穩(wěn)定性，還可以彌補常規(guī)構(gòu)建的人源組織腫瘤細胞系不能維持腫瘤異質(zhì)性，以及人源組織腫瘤異種移植效率低、周期長等缺點[7-26]。隨著研究技術(shù)的不斷完善和成熟，越來越多數(shù)據(jù)表明了類器官組織已在多種疾病和應用研究領(lǐng)域(包括感染腫瘤致病機制、藥物試驗、個體化治療等方面)發(fā)揮重要作用[7-26]。因此，本文針對類器官組織在感染性疾病模型和應用研究領(lǐng)域的進展進行綜述，期望對讀者了解該領(lǐng)域的研究動態(tài)有所幫助。

1 類器官發(fā)展概況

類器官是一種在體外環(huán)境下培育而成的具有3D結(jié)構(gòu)的“迷你器官”(mini-organs)，擁有類似真實器官的復雜結(jié)構(gòu)，并能最大限度模擬來源組織或器官的生理功能，同時還可以在體外進行傳代和凍存。除了正常組織的干細胞能夠在體外3D培養(yǎng)生長為類器官外，腫瘤組織也可經(jīng)體外3D培養(yǎng)生長為腫瘤類器官。目前，類器官3D培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)涉及多種人體多種組織器官，如胰腺、腦、視網(wǎng)膜、肝、脾、前列腺和肺等(見圖1)[7-26]。類器官的概念最早于1946年由Smith和Cochrane[27]在皮樣囊腫(dermoid cysts)的研究中提出，但直到2014年Lancaster和Knoblich[28]才明確定義了類器官是以干細胞或器官組織細胞為原料，經(jīng)體外培養(yǎng)分化后自組裝為器官樣結(jié)構(gòu)的細胞群。在類器官發(fā)展進程中最重要的里程碑發(fā)現(xiàn)是，2009年Clevers團隊將小腸上皮絨毛-隱窩(crypt-villus)基底部來源的Lgr5+干細胞(Lgr5+ stem cells)從小鼠體內(nèi)分離處理后加到含有生長因子的基質(zhì)膠中，Lgr5+干細胞能夠在3D基質(zhì)膠的支撐下，生長分化成為中空的囊腔狀球體類器官，高度模擬小腸上皮在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能以及基因的穩(wěn)定性[7,29]。在此項研究的基礎(chǔ)上，通過前期摸索，本課題組也已成功建立了腸道類器官的培養(yǎng)體系(見圖2)。同年Gao等[30]從臨床前列腺腫瘤患者活檢組織中亦成功地培育出人前列腺腫瘤類器官，并證實腫瘤類器官可用于體外藥物檢測與體內(nèi)異種移植。

圖1 不同組織類器官的發(fā)展歷程

The crypts were isolated from adult mouse intestine, and grown as three-dimensional spheroids in matrigel covered by 50% conditioned medium collected from the supplement of L-WRN cells. Crypts formed spheroid structures on day 1 and could bud on day 5.

2016年Nozaki等[31]建立了小腸類器官與小腸上皮T細胞共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)類器官微環(huán)境可以提高T細胞體外的生存時間，而且T細胞的運動軌跡與在動物體內(nèi)的相似。根據(jù)該研究，本課題組也成功建立了小腸類器官與T淋巴細胞共培養(yǎng)體系(見圖3)。隨后，Dijkstra等[32]通過將人腫瘤類器官與自身外周血淋巴細胞共培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)可以從結(jié)腸癌和非小細胞肺癌患者外周血中富集腫瘤反應性T細胞，并證明富集的反應性T細胞可用來評估腫瘤類器官的殺傷效果，進一步推動了腫瘤免疫治療的發(fā)展。

Intestinal organoids were cultured for 2 days prior to co-culture with T cells. On the day of co-culture, T cells with GFP were isolated from EGFP transgenic mice, and organoids were released from matrigel. 100 organoids and 1.0×105 T cells were mixed with DMEM and placed together onto a 24-well plate to solidify at the incubator for 30 mins and covered by 50% conditioned medium with IL-2, IL-7 and IL-15. The medium was refreshed every 2 days and image after co-culture 48 h. The data was analysed by Imaris software, and the long orange arrows show the T cells entrance into the organoids, the short blue arrows show the T cells outside of the organoids. In picture D, the red balls stand for the T cells with GFP in Imaris software and the different lines show the moving path of T cells.

2019年Wimmer 等[26]首次從多功能干細胞中成功培育出包含有內(nèi)皮細胞與管周細胞的人體血管類器官。將人體血管類器官移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)95%的人血管類器官能夠在小鼠體內(nèi)存活并生長達6個月之久，血管類器官在小鼠體內(nèi)能正常發(fā)育成功，有完善的動脈、靜脈及毛細血管。通過對人血管類器官移植小鼠進行藥物處理誘導糖尿病后發(fā)現(xiàn)，人體血管類器官基底膜增厚，模擬了糖尿病患者的微血管變化。人血管類器官能夠再現(xiàn)人類血管的結(jié)構(gòu)與功能，為血管疾病和糖尿病等多種基礎(chǔ)性疾病的防控提供了新的思路。同年，Cakir等[33]在研究腦類器官時，在培養(yǎng)的人皮質(zhì)類器官(human cortical organoids，hCOs)中表達ETV2轉(zhuǎn)錄因子，成功形成具有微血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和類血-腦屏障結(jié)構(gòu)的血管化人皮質(zhì)類器官(vascularized hCOs，vhCOs)。該項研究不僅提高了腦類器官的培養(yǎng)成熟度和分化程度，還克服了類器官缺乏血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的弊端。血管類器官和具有血管結(jié)構(gòu)腦類器官的研究成為類器官研究的又一個重要里程碑。

隨著類器官研究技術(shù)的不斷成熟，類器官血管形成、神經(jīng)支配及與免疫細胞共培養(yǎng)等技術(shù)瓶頸的不斷突破，類器官應用范圍將越來越廣泛。

2 感染性疾病及其研究模型

2.1 感染性疾病

近年來，癌癥嚴重危害著人類的身心健康，已成為世界范圍內(nèi)死亡率顯著上升的一個重要原因。2017年全球十大癌癥發(fā)病排名指出，結(jié)腸癌和直腸癌(colon and rectum cancer)位居第4，乳腺癌(breast cancer)位居第3，氣管、支氣管和肺癌(tracheal, bronchus, and lung cancer)位居第2，非黑色素皮膚癌(nonmelanoma skin cancer)位居第1，此外胃癌(stomach cancer)、肝癌(liver cancer)等發(fā)病率亦居高不下[34]。預計到2025年，每年將有 1 930 萬新發(fā)癌癥病例，并且一半以上的癌癥病例和死亡病例將發(fā)生在中低收入國家[35-36]。2019年9月，Christina等報道，癌癥和其他非傳染性疾病已成為全球健康發(fā)展的主要威脅，并預計癌癥將成為21世紀人類因疾病死亡的主要原因和增加預期壽命的最主要障礙[34,37]，該聲明進一步強調(diào)了深入研究癌癥對于世界健康發(fā)展的重要性。

引起癌癥發(fā)生、發(fā)展的因素是多方面的，包括外在物理因素(電輻射、紫外線等)，化學因素(亞硝胺類、黃曲霉素等)，不良的生活習慣(吸煙、飲酒、熬夜等)，遺傳因素(基因突變或缺失等)以及病原體感染等。研究表明，99%的人在其一生中至少被一種疾病相關(guān)病原感染，但是癌癥發(fā)生、發(fā)展的很多具體機制至今尚不清楚[34,37]。由病原體感染所致的腫瘤又被稱為感染性腫瘤，據(jù)研究報道，至少約有15%～20%的癌癥與病毒感染相關(guān)，如人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)與宮頸癌，HBV/丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)與肝癌[38]。第1個被證實的感染性腫瘤是1911年由Rous[39]發(fā)現(xiàn)的由致瘤病毒——勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)感染引發(fā)禽類的勞斯肉瘤(Rous sarcoma)。Epstein等[40]在Burkitt淋巴瘤細胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)人類第1個致瘤性病毒——EB病毒，該病毒被證實與多種淋巴瘤及鼻咽癌密切相關(guān)。隨后，HBV與肝癌，HPV與宮頸癌，人類嗜T淋巴細胞病毒-1(human T-cell lymphotropic virus type-1, HTLV-1)與成人T細胞白血病，人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)與艾滋病，KSHV與卡波西肉瘤等病毒與癌癥的相互作用關(guān)系被先后報道，進一步證實感染在疾病發(fā)生中的重要作用[41]。

引發(fā)感染性疾病的病原不僅包含病毒，還有多種細菌與寄生蟲。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是第1個被證實能夠引發(fā)胃炎及胃癌的細菌[42-46]。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)梭形桿菌、卟琳單胞菌、鏈球菌等與結(jié)腸癌相關(guān)，傷寒沙門菌與膽囊癌相關(guān)[47]，巴爾通體與血管瘤相關(guān)[48]。寄生蟲引發(fā)疾病的研究也逐漸成熟，現(xiàn)已證實肝吸蟲能引起膽管癌，血吸蟲能引發(fā)膀胱癌，陰道毛滴蟲與弓形體分別與前列腺癌和腦腫瘤形成相關(guān)[49-50]。

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)統(tǒng)計，感染人類的病原體中至少有12%會引起新發(fā)感染性疾病[51]，包括由瘧原蟲感染引起的瘧疾，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)引發(fā)的SARS, 禽流感病毒感染人引發(fā)的流感，中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)引發(fā)的MERS，埃博拉病毒(Ebola virus)引發(fā)的出血熱，寨卡病毒(Zika virus)感染所致的畸形及現(xiàn)在正在流行的由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2)引發(fā)的2019冠狀病毒病(corona virus disease 2019，COVID-19)。這些病原感染所致的新發(fā)感染性疾病，由于發(fā)病急、傳染性強，一旦發(fā)病就會迅速流行，因此，針對感染性疾病的研究尤為關(guān)鍵。

2.2 疾病研究模型

目前在腫瘤研究領(lǐng)域較為常用的模型為2D水平的細胞模型、3D水平的類器官模型和動物模型。2D水平的細胞模型雖能在體外維持腫瘤的無限增殖與侵襲生長能力，但不能維持腫瘤體內(nèi)的異質(zhì)性(如臨床上某些常見的癌基因突變，在細胞模型中并不存在)[52-53]；動物模型雖能較好地維持腫瘤的異質(zhì)性，但存在物種跨越的局限性，并對藥物的反應性不穩(wěn)定，且耗時耗力，還存在一定的倫理問題[54]；而3D水平的類器官模型不僅可以維持腫瘤的異質(zhì)性，高度模擬體內(nèi)原位組織的生理結(jié)構(gòu)和功能，還可以在基因水平進行基因編輯，操作簡單方便，更利于觀察組織細胞的生長、運動等情況。類器官模型很好地彌補了細胞模型與動物模型的缺陷，為感染性疾病的體外研究提供了更好的前景，可廣泛應用于疾病模型、藥物篩選等多方面的研究，其應用前景十分廣闊，被譽為“朝陽研究”[55-56]。

3 類器官在病原感染性疾病研究中的應用

因類器官與來源器官組織的基因、結(jié)構(gòu)和功能的高度相似性，其已廣泛應用于模擬體內(nèi)組織細胞生長、分化和器官形成過程，以及藥物篩選與評價、個性化治療、生物醫(yī)學材料及組織工程等方面。隨著病原體感染與腫瘤發(fā)生關(guān)系研究的深入，感染性疾病已成為腫瘤研究領(lǐng)域的焦點問題。作為新型的研究模型，3D技術(shù)培養(yǎng)的類器官結(jié)合顯微注射技術(shù)能更好地模擬宿主與病原體之間的相互作用，將為研究疾病的發(fā)生、發(fā)展、結(jié)局、轉(zhuǎn)歸，藥物選擇，個體化治療以及精準醫(yī)學等領(lǐng)域提供新的方向[57]。現(xiàn)已有多種類器官作為疾病感染模型。

3.1 消化道類器官

胃腸道類器官研究較為成熟，其感染模型應用也較為廣泛。Bartfeld和Clevers[58]從人胃組織中分離出胃腺體，經(jīng)處理后加入基質(zhì)膠中并添加必要生長因子如表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、R-spondin和Noggin等，成功在體外培養(yǎng)出胃類器官，并且利用顯微注射技術(shù)，將幽門螺桿菌注入胃類器官中，觀察幽門螺桿菌在胃類器官中定植的過程；Jiao等[59]用沙門菌感染小鼠小腸類器官，發(fā)現(xiàn)沙門菌的效應蛋白AvrA通過抑制自噬關(guān)鍵蛋白Beclin-1的表達，從而抑制自噬并促進細菌入侵宿主細胞進而在宿主內(nèi)定植。Saxena等[60]收集不同患者腸道組織經(jīng)體外培養(yǎng)人腸道類器官后，通過人輪狀病毒感染實驗，發(fā)現(xiàn)病毒能夠引起類器官生理性管腔擴張。以上實驗模擬了輪狀病毒引起生理性腹瀉的特征，從細胞水平研究腸道病毒—宿主的相互作用，為人類輪狀病毒和其他腸道病原體(如人類諾如病毒、星形病毒和圓環(huán)病毒以及寄生蟲和細菌)致病機制的研究提供了可行的感染模型。Drummond等[61]發(fā)現(xiàn)埃可病毒11型(Echovirus 11，E11)、柯薩奇病毒B組(Coxsachie virus B，CVB)和腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)等腸道病毒能夠感染腸道類器官，激活炎癥信號通路誘發(fā)抗病毒反應，進一步佐證腸道類器官能夠高度模擬原位腸道的免疫防御和抗病原體保護功能。Ettayebi等[62]通過人諾如病毒HuNov感染腸道類器官建立腸道感染模型，并通過這種腸道類器官模型研究HuNov感染復制與組織血型抗原表達之間的作用關(guān)系，為其他腸道病毒與宿主相互作用研究提供了參考。2017年，Zhou等[63]利用MERS-CoV感染小腸類器官，發(fā)現(xiàn)小腸類器官對MERS-CoV高度易感，為 MERS-CoV致病機制的研究提供有效的研究模型。Lamer等[64]用4種不同的方法培養(yǎng)小腸類器官，并用SARS-CoV與SARS-CoV-2分別進行感染，通過激光共聚焦顯微鏡觀察類器官中被感染細胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在感染24 h可見單個感染的細胞，感染60 h內(nèi)被感染細胞數(shù)量逐漸增加，隨后對感染60 h的類器官進行電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在類器官管腔及基底細胞內(nèi)出現(xiàn)80～120 nm的病毒顆粒，表明小腸類器官可作為研究冠狀病毒感染的新實驗模型。

3.2 呼吸道類器官

Zhou等[65]利用肺組織中的成體干細胞培養(yǎng)出3D生長的氣道類器官，經(jīng)誘導分化后成功模擬了自然情況下流感病毒感染人類呼吸道的過程，為人類呼吸系統(tǒng)疾病提供了一個嶄新的研究平臺。2019年Sachs等[25]從呼吸道患者支氣管肺泡切除或灌洗材料中培養(yǎng)出氣道類器官，通過呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)感染氣道類器官實驗發(fā)現(xiàn)，病毒能夠利用其NS2非結(jié)構(gòu)蛋白增強類器官的活力；同年，Porotto等[66]利用人多能干細胞培養(yǎng)肺支氣管類器官，建立兒童及嬰幼兒末梢肺組織副流感病毒感染模型，為呼吸道病毒感染及宿主病原相互作用關(guān)系研究提供了更好的模型。

3.3 腦類器官

Garcez等[67]用誘導性多功能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)培養(yǎng)人腦類器官，并用寨卡病毒和登革病毒2型(dengue virus type 2，DENV-2)分別感染人大腦類器官，發(fā)現(xiàn)寨卡病毒感染腦類器官后可以抑制類器官的生長，抑制效率高達40%，與臨床上寨卡病毒感染引起的兒童先天性小腦畸形的結(jié)果一致，而DENV-2感染并未引起類器官生長抑制。Zhang等[68]從人胚胎干細胞培養(yǎng)出端腦皮質(zhì)類器官，該類器官具有多層前體區(qū)和所有6種神經(jīng)元亞型，與人體內(nèi)皮質(zhì)發(fā)育相似。通過日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染端腦皮質(zhì)類器官實驗研究JEV與日本腦炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)JEV感染能夠促進腦類器官細胞死亡，導致類器官體積變小。

3.4 肝膽類器官

Huch等[69]通過培養(yǎng)小鼠肝臟類器官進行HBV和HCV感染實驗，研究病毒與肝炎、肝硬化及肝癌間的相互作用；在研究沙門菌與膽囊癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系時，Scanu等[19]建立沙門菌感染鼠膽囊類器官模型，發(fā)現(xiàn)沙門菌感染可以誘導膽囊類器官TP53變異、C-myc擴增，從分子水平證實沙門菌是引起膽囊癌變的重要因素。在SARS-CoV-2引發(fā)COVID-19的關(guān)鍵時刻，Zhao等[70]應用人肝臟膽管類器官建立SARS-CoV-2感染模型，發(fā)現(xiàn)感染24 h后可檢測到SARS-CoV-2的核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N protein)，在膽管類器官內(nèi)SARS-CoV-2載量顯著增加，但是感染48 h后病毒載量下降。同時，上述研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染降低了類器官中Claudin 1的表達，并下調(diào)兩個關(guān)鍵膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(頂端鈉離子/膽汁酸轉(zhuǎn)運體與囊性纖維化穿膜傳導調(diào)節(jié)蛋白)，揭示SARS-CoV-2感染引發(fā)患者膽管功能紊亂和膽汁淤積，進而導致肝臟損傷。

3.5 血管類器官

Monteil等[71]通過iPSC成功培養(yǎng)出人毛細血管類器官，并用臨床分離的SARS-CoV-2毒株感染該血管類器官，感染3 d和6 d后用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測病毒RNA，發(fā)現(xiàn)感染6 d的病毒RNA載量明顯高于感染3 d的病毒載量。SARS-CoV-2感染血管類器官6 d后的培養(yǎng)上清液能夠再次感染Vero E6細胞，表明病毒在類器官中可以增殖并產(chǎn)生具有感染能力的子代病毒。

3.6 腎臟類器官

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)能夠促進血管緊張素的成熟，在肺、心臟、腎臟和腸道中廣泛存在，是SARS-CoV-2感染進入人體細胞的重要受體。Monteil等[71]從人胚胎干細胞培養(yǎng)出腎臟類器官，并發(fā)現(xiàn)腎類器官中含有表達ACE2的細胞簇。通過臨床分離的SARS-CoV-2毒株感染腎類器官建立了病毒感染模型，加入人源可溶性重組ACE2(hrsACE2)能夠有效抑制SARS-CoV-2在腎臟類器官中的增殖，抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性，結(jié)果表明hrsACE2可以抑制SARS-CoV-2增殖并阻斷病毒進入宿主細胞，為COVID-19的治療與防控提供了新的方向。

4 結(jié)語與展望

類器官是利用體外3D技術(shù)培養(yǎng)干細胞而形成的多功能細胞團，具有自身增殖和多向分化的能力[72]，能夠高度模擬原位組織的結(jié)構(gòu)和功能，已廣泛應用于疾病建模、基因編輯、高通量藥物篩選、毒性試驗、新型治療方法的開發(fā)、再生醫(yī)學等方面，成為研究人類發(fā)育過程及疾病機制的有效平臺[25,73]。盡管如此，類器官在感染性疾病研究中的應用尚處于初級階段，仍存在應用的局限性及一些亟待解決的問題：由于培養(yǎng)類器官所用的基質(zhì)膠來源于動物肉瘤組織，可能會對細胞性質(zhì)及藥物篩選過程中的反應性產(chǎn)生未知的影響，限制了類器官在人體器官移植中的應用；iPSC衍生的類器官多數(shù)需要飼養(yǎng)層細胞，這增加了培養(yǎng)過程的復雜程度；類器官成像也是科學研究常面臨的問題，高通量深度掃描成像能夠改善類器官成像效果；大部分類器官缺乏血液、血管、淋巴管、免疫細胞和外周血管神經(jīng)等基質(zhì)成分，器官功能不成熟，不能很好地模擬疾病的發(fā)生過程[74]；類器官的體積大小是限制其發(fā)展的關(guān)鍵因素，而類器官內(nèi)氧與營養(yǎng)成分擴散的程度取決于其大小，缺氧及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏導致的類器官死亡是亟須解決的問題[75]。盡管類器官研究中存在這些限制，但這一技術(shù)的搭建實現(xiàn)了從基礎(chǔ)到臨床的快速轉(zhuǎn)化，為感染性疾病尤其是新發(fā)傳染性疾病致病機制研究、靶向藥物篩選及個性化治療提供了新的平臺，將廣泛應用于基礎(chǔ)與臨床領(lǐng)域的相關(guān)研究。