鈣離子、鎂離子對戊型肝炎病毒感染PLC/PRF/5細胞的影響

張黎，黃維金

中國食品藥品檢定研究院艾滋病性病病毒疫苗室，北京 102629

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)主要經糞-口途徑傳播，通常引起急性病毒性肝炎。其臨床癥狀類似于甲型肝炎，但病死率高。流行病學調查顯示，HEV在世界各地廣泛流行[1]。我國是HEV的高發地區，對獻血志愿者中的抗HEV IgG篩查結果顯示，陽性率約為23%～40%[2-3]。Nimgaonkar等[1]的研究提示，HEV還可以通過胎盤垂直傳播以及輸血傳播。在一些抵抗力低下的特殊人群中，如器官移植者、免疫缺陷者等，戊型肝炎還可能發展為慢性肝炎。

目前，發現的HEV主要基因型有1～4型、兔HEV、禽HEV以及鼠HEV等[4]。 我國人群中流行的主要為HEV 1型和4型，其中HEV 1型只能感染人， HEV 4型為人畜共患，豬是其主要宿主[5]。近年來，我國新增的戊型肝炎患者多為HEV 4型。HEV為正鏈單鏈RNA病毒，雖然經由糞便排出的病毒顆粒不具有包膜，但最近的研究提示患者血液中的病毒顆粒以及細胞培養產生的病毒均具有包膜形式[6]。

HEV分離至今已有30余年，但由于缺乏穩定的體外培養系統，其感染細胞的機制尚未研究清楚[7]。PLC/PRF/5細胞(人肝癌亞歷山大細胞)是目前國內外最常用的HEV培養用細胞系，有研究提示氯化鎂的加入可以促進PLC/PRF/5細胞產生病毒[7]。另外，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)與肝細胞的結合也在一定程度上具有鈣離子依賴性[8-9]。本研究通過改變該培養體系中的鈣離子、鎂離子含量，觀察2種離子對于HEV結合細胞以及HEV感染后PLC/PRF/5細胞產生病毒的影響，期望增加病毒產量，以提高獲得病毒的效率，為研究病毒發病機制提供實驗數據和工具。

1 材料與方法

1.1 細胞及毒株

PLC/PRF/5細胞來源于美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection， ATCC)，由中國食品藥品檢定研究院細胞資源保藏中心保藏。將PLC/PRF/5細胞置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中，用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+1%青、鏈霉素的最低必需培養基(minimum essential medium，MEM)培養。用0.25%胰酶+乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA)消化細胞進行傳代，維持細胞指數生長。實驗中所用HEV為本室分離的4型HEV，來源于人體糞便，經由PLC/PRF/5細胞培養擴增后，收獲培養上清液為毒種(GenBank Acc No：AJ272108)。

1.2 主要試劑

MEM購自中國浙江吉諾生物公司。胎牛血清購自美國Hyclone公司。HEV抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法)購自北京萬泰生物藥業有限公司。病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒購自北京莊盟生物科技有限公司。戊型肝炎核酸檢測試劑盒(熒光定量PCR法)購自北京金豪制藥股份有限公司。

1.3 PLC/PRF/5細胞病毒感染實驗

將PLC/PRF/5細胞鋪于24孔板中，待細胞密度達到80%～90%時，加入HEV毒種(RNA濃度1×106拷貝/mL)，并換用含2% FBS的MEM。同時在鈣離子實驗組加入20 mmol/L CaCl2；在鎂離子實驗組加入30 mmol/L MgCl2；混合實驗組同時加入20 mmol/L CaCl2和30 mmol/L MgCl2；在金屬離子螯合劑EDTA組加入10 mmol/L EDTA；在乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)組加入10 mmol/L EGTA；對照組除加入病毒外，不進行其他處理。分別于感染1 h和24 h時，將細胞用無血清MEM洗5遍，收獲細胞，提取細胞內核酸，檢測細胞內HEV核酸含量。另于感染24 h后，用無血清MEM洗5遍，加入新鮮的維持培養基于37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養。之后每7 d換1次培養液，從2周起收取上清液，檢測細胞培養上清液中HEV的核酸含量和開放讀碼框(open reading frame，ORF)2蛋白含量。

1.4 HEV抗原(ORF2)檢測

按照HEV抗原檢測試劑盒說明書進行，步驟如下：在預包被的96孔板中， 按100 μL/孔加入待測樣品和陰性、陽性對照，于37 ℃孵育1 h。以磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline with Tween-20，PBST)為洗液，用洗板機洗板5次后，加入酶標試劑100 μL/孔，于37 ℃孵育30 min。再次洗板5次后，加入顯色液A和B(各50 μL/孔)，混勻后于37 ℃孵育15 min。加入終止液(50 μL/孔)，混勻后用酶標儀讀數(吸光度值，A450)。計算S/Co值，即待測樣品A值/陰性對照平均值。

1.5 HEV核酸檢測

首先，按照病毒基因組提取試劑盒說明書進行病毒核酸提取。分別向200 μL的病毒上清液或全細胞混懸液中加入400 μL裂解液，充分渦旋振蕩混勻后，加入450 μL無水乙醇，振蕩混勻并加入吸附柱中，13 000 轉/min離心1 min。分別加入500 μL去蛋白液漂洗1次，漂洗液漂洗2次后， 13 000 轉/min離心2 min，棄盡殘余液，加30 μL無RNA酶的水洗脫獲得病毒RNA。接著用HEV RNA熒光PCR檢測試劑盒進行RNA定量檢測。主要步驟如下：在無核酸酶的離心管中先后加入20 μL×n的HEV反應液，0.60 μL×n的Taq聚合酶，0.20 μL×n的反轉錄酶(n為待反應管數+1)，振蕩混勻后 13 000 rpm離心30 s，以20 μL/管分裝至熒光PCR專用檢測管。向檢測管中分別加入10 μL待檢測RNA，放入熒光PCR儀中進行檢測。RNA反轉錄及變性后，先經過5個循環的預擴增，再進行擴增并于55 ℃收集羧基熒光素(carboxyfluorescein)熒光信號。該方法為本研究室前期建立，擴增ORF 3蛋白，引物為F: 5′-CGGTGGTTTCTGGGGT-GA-3′，R: 5′-GCGAAGGGGTTGG-TTGGA-3′； 探針為5′-FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGCT-AMRA-3′。實驗中采用pcDNA3.1-ORF 3質粒作為陽性對照質粒[10]。

1.6 統計學方法

用Graphpad prism 8進行作圖及統計學分析，數值以均數±SEM的形式表示。用單因素方差(ANOVA)分析及t檢驗比較各實驗組與對照組間的差異。P<0.05代表有顯著性差異。

2 結果

2.1 鈣離子和鎂離子促進HEV結合進入細胞

細胞內HEV RNA檢測結果顯示，病毒加入1 h后，鈣離子實驗組與對照組相比，細胞內HEV核酸拷貝數由2.1×104/mL增加到1.65×105/mL，增加了7.8倍(見圖1A)。病毒加入24 h后，細胞內HEV的拷貝數由1.3×105/mL增加到1.11×106/mL，增加了8.2倍(見圖1B)。該結果提示，CaCl2能夠促進HEV感染細胞。同樣，鎂離子實驗組在感染HEV 1 h后，細胞內HEV的核酸拷貝數為7.0×104/mL，與對照組相比增加了3.3倍(見圖1A)。24 h后細胞內核酸拷貝數為2.9×105/mL，與對照組相比增加了2.1倍(見圖1B)。鎂離子對于HEV感染細胞的促進作用弱于鈣離子。此外，試驗設立了金屬離子螯合劑EDTA組和EGTA組。細胞內HEV RNA檢測結果顯示，病毒加入1 h后，EGTA組與對照組相比細胞內HEV核酸拷貝數幾乎不變，而EDTA組細胞內HEV拷貝數增加了3.0倍(見圖1A)。病毒加入24 h后, EGTA組細胞內HEV的拷貝數由1.3×105/mL降低到4.0×104/mL，而EDTA組降低到3.0×104/mL，均降低了約2/3(見圖1B)。該結果顯示金屬離子螯合劑能夠抑制HEV感染，間接支持鈣離子、鎂離子促進HEV感染細胞的作用。

2.2 鈣離子和鎂離子促進PLC/PRF/5細胞產生病毒

為了觀察鈣離子、鎂離子對于PLC/PRF/5細胞的長期影響，在實驗組HEV感染細胞的維持培養液中加入鈣離子(20 mmol/L CaCl2)或鎂離子(30 mmol/L MgCl2)，于感染后不同時期，收集細胞培養上清液分別檢測HEV核酸含量以及ORF 2蛋白含量。結果顯示，HEV感染后2周，鈣離子實驗組細胞培養上清液中的病毒拷貝數與對照組相比增加了3.0倍，且于感染后3～4周保持相同趨勢(見圖2A)。與之相對應的是，酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)結果顯示鈣離子實驗組ORF 2蛋白含量于感染后2周增加了3.0倍，且感染后2～5周該趨勢保持不變(見圖2B)。同樣，鎂離子的加入也使得細胞培養上清液中的HEV核酸和ORF 2蛋白量有所增加，但其增加的程度不如鈣離子組，分別為HEV核酸拷貝數增加了1.8倍(見圖2A)，ORF 2蛋白分泌增加了1.7倍(見圖2B)。而在鈣離子、鎂離子混合實驗組中，已感染HEV的PLC/PRF/5細胞擴增病毒的能力高于鎂離子組，但是不如鈣離子組(見圖2A和2B)。該結果提示鈣離子、鎂離子對于HEV感染后長期培養的PLC/PRF/5細胞的產毒能力均具有促進作用，其中鈣離子的作用強于鎂離子，但二者并無協同作用。采用ANOVA分析提示，無論是熒光定量PCR檢測HEV核酸拷貝數(P=0.033 9)，還是ELISA檢測ORF 2蛋白含量(P=0.006 6)，各實驗組結果與對照組相比都具有統計學差異(P<0.05)。

3 討論

高效穩定的體外培養體系是研究HEV結構、特性及致病機制的基礎。自HEV被發現以來，科學家們曾多次嘗試體外培養HEV，先后嘗試了一些細胞系包括2BS、A549、HepG2以及非人靈長類的原代肝細胞，但一直很難獲得較高滴度的HEV[11]。直到2007年，日本科學家Okamoto等[12]首次在PLC/PRF/5細胞及A549細胞中成功培養了來自人糞便的3型HEV病毒株 HE-JF5/15F。此后，該研究小組利用相同體系先后從暴發性肝病患者糞便中成功分離培養了HEV 4型病毒，從1、3和4型HEV患者血清中分別分離出相應型別的HEV[13]。

Purcell等[14]對HEV培養進行了探索，該課題組并不能很好地重復Okamoto等的研究成果，但建立了以HepG2細胞為基礎的培養體系，并成功構建了感染性克隆，發現了一段包含174個核苷酸的來自人核糖體蛋白的插入序列，這對于HEV的適應性培養至關重要。

本課題組在借鑒前期研究結果的基礎上，成功培養了來自恒河猴糞便的4型HEV，發現在低血清情況下，PLC/PRF/5細胞處于不增殖的狀態，細胞的形態和生長狀態亦無明顯變化。在低血清維持培養基培養1個月左右，可在培養上清液中檢測到HEV。通過對病毒接種濃度、接種時間、接種溫度和培養基成分的探索，對培養條件做了進一步的優化。優化后，病毒可以被檢測到的時間為感染后 15～21 d，病毒分泌高峰時上清液中HEV RNA濃度可高達1×108拷貝/mL[15]。而本研究則在此基礎上探討鈣、鎂離子的作用。結果顯示，HEV感染細胞后1～24 h，鈣離子、鎂離子的加入能夠促進病毒與細胞的結合。HEV感染后2～5周，鈣離子、鎂離子均能夠增加PLC/PRF/5細胞培養上清液中產生的病毒，其中鈣離子的促進作用更加顯著。結果提示，鈣離子、鎂離子對于HEV感染后長期培養的PLC/PRF/5細胞的產毒能力均具有促進作用，其中鈣離子的作用強于鎂離子，但二者無協同作用。

鈣離子作為細胞內的第二信使，能與多種鈣結合通道及受體結合，發揮信號傳導等非常重要的作用[16]。本課題組前期發現的能夠促進HEV感染細胞的輔助性受體去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR), 即為鈣依賴受體，鈣離子的存在為該受體發揮作用所必需。鈣離子通過增強該受體發揮作用，可能是其促進HEV感染細胞的原因之一[17]。另有研究報道，鈣離子可以通過促進HBV核心蛋白的組裝來提高HBV在細胞內的復制能力[18]。但鈣離子在HEV的復制過程中是否也通過類似機制發揮促進作用，仍須實驗證明。

EDTA與EGTA同為金屬離子螯合劑，能夠結合游離的鈣離子、鎂離子，阻止它們與細胞的結合。本研究發現，在加入后1 h，EDTA能促進HEV結合細胞。而加入24 h后，EGTA與EDTA均能夠抑制HEV與PLC/PRF/5細胞的結合。原因可能與EDTA和EGTA的作用機制不同相關。EGTA具有相對較強的鈣離子結合能力，而其結合鎂離子的能力弱于EDTA。另外，二者都能結合其他金屬離子，因此不排除鈣離子、鎂離子外其他金屬離子對HEV感染細胞的影響。

綜上所述，本研究發現在HEV細胞培養體系中加入鈣離子和鎂離子，不僅能在病毒感染早期增加病毒與細胞的吸附、進入，還能在被感染細胞的長期培養過程中，促進病毒的產生，且鈣離子的作用強于鎂離子。這一結果不僅解釋了文獻報道的HEV培養基中添加鎂離子的原因，也為今后HEV培養體系的優化提供了新的線索和依據。然而鈣離子、鎂離子發揮作用的機制以及離子濃度的進一步優化仍有待深入研究。