肺炎克雷伯菌基因組可移動遺傳元件的研究進展

浦炳春，秦金紅

1. 上海交通大學醫學院，上海 200025; 2. 復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心上海噬菌體與耐藥研究所，上海 200540

肺炎克雷伯菌是臨床上常見的機會致病菌，可引起廣泛感染，導致肺炎、尿路感染、菌血癥和肝膿腫等疾病[1]。其毒力因子主要包括具有抗吞噬作用的莢膜多糖[2]、可引發宿主敗血癥和敗血性休克的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[3]、能獲取宿主體內鐵元素的鐵載體[4]以及通過黏附于人類黏膜或上皮表面而致病的菌毛[5]。近年來，耐藥肺炎克雷伯菌的感染率逐年升高，而可供選擇的抗菌藥物越來越少，導致耐多藥(multidrug-resistant，MDR)肺炎克雷伯菌感染造成的死亡率高達40%～50%[6]。

肺炎克雷伯菌基因組大小為5～6 Mbp，G+C含量一般在50%～60%，編碼 5 000～6 000 個基因。其中約1 700個基因是保守的，稱為核心基因；其余基因則各有不同，稱為輔助基因，包括染色體編碼基因和可移動遺傳元件(mobile genetic element，MGE)基因組。基于1 000～2 000個核心基因的系統進化樹分析表明，肺炎克雷伯菌有數百個遺傳型，彼此之間核苷酸差異在0.5%左右[7]。肺炎克雷伯菌基因組具有高度可塑性，其中通過水平而頻繁轉移的可移動基因組是導致其基因組多樣性的主要原因。可移動基因組對肺炎克雷伯菌的耐藥性和致病性有重要作用，因為其毒力基因和耐藥基因通常位于MGE，并通過細菌之間的水平轉移而獲得。

細菌的可移動基因組是指一個細菌基因組內的全部MGE，包括質粒(plasmid)、插入序列(insertion sequence，IS)、前噬菌體(prophage)、整合性接合元件(integrative and conjugative element，ICE)等，其作用是介導細菌基因組內或細菌細胞之間DNA移動，且通過自身攜帶的功能基因促進宿主生長及提高對環境的適應性[8](見圖1)。本文就肺炎克雷伯菌基因組中的可移動遺傳成分及其在基因組進化中的作用進行綜述。

1 質粒

質粒是最常見的 MGE，通常指在宿主細胞中能夠獨立于染色體自主復制的線性或環狀DNA分子。質粒不僅攜帶可促進宿主生存的優勢基因，還攜帶其他 MGE，如 IS、整合子和轉座子等。根據可否轉移，質粒分為接合型、可移動型和不可移動型[9]。接合是DNA通過細胞間直接物理連接從供體菌轉移到受體菌，一般由接合型質粒介導，是耐藥基因轉移的重要機制。接合轉移是一個復雜過程，主要包括轉移起始位點缺刻、DNA轉移起始、雙鏈分離、單鏈轉移、供體和受體互補鏈的合成及再環化等[10]。對于接合型質粒和可轉移質粒而言，接合機制中唯一的蛋白質成分是松弛酶，其為接合中的關鍵蛋白，是一種位點特異性核酸內切酶，能識別轉移起點oriT(短DNA序列，是質粒接合轉移中的唯一序列)。松弛酶在接合的初始和最終階段發揮作用，即作用于供體中的oriT位點，使雙鏈DNA切割成可轉移的單鏈DNA，并在一些輔助蛋白(如T4CP)的幫助下將可移動的DNA單鏈通過Ⅳ型分泌系統(type Ⅳ secretion system，T4SS)或性菌毛等介質接合轉移到受體細胞中[11]。F質粒是在細菌中發現的第1個接合質粒，也是最早發現的與抗生素抗性轉移相關的質粒，是目前腸桿菌科中發現的最豐富的質粒類型[12]。

目前，對肺炎克雷伯菌質粒的分析主要基于基因組測序數據，使用replicon基因和relaxase(mob)基因進行質粒分析及分型。對已測序的肺炎克雷伯菌基因組進行分析，發現其基因組中質粒數量為 0～12個。目前在肺炎克雷伯菌基因組中發現的質粒類型多達19種，主要包括IncFII、IncN、IncR和IncX3幾類不相容類型，這些質粒通常比較大且為接合型質粒。在肺炎克雷伯菌基因組中，大多數水平獲得的抗性基因主要通過這些不相容的大的接合型質粒傳播，其中FIBk復制子為主要的抗性及毒力質粒，FⅡk和R復制子亦為主要的大的接合型復制子。研究者在肺炎克雷伯菌基因組中還發現了小型復制子，如Col復制子及F質粒的變種FⅡ、FⅠA和 FⅠB也攜帶和轉移耐藥基因。還發現了其他類型的復制子如IncX3 N、HI1B和AC/2型復制子[13]。隨著肺炎克雷伯菌全基因組測序數據的增加，許多不同長度和不相容性類型的質粒不斷被發現[14]。某些肺炎克雷伯菌能允許質粒攝取和維持，導致質粒載量通常大于大腸埃希菌和其他革蘭陰性菌[15]。例如，肺炎克雷伯菌分離株常攜帶4～6種不同質粒，多者能攜帶10種[16]。

除了耐藥基因，肺炎克雷伯菌的毒力基因也通過質粒攜帶，這些質粒被稱作毒力質粒。最具特征的毒力質粒是來自血清型K1的ST23型菌株NTUH-K2044中的質粒pK2044、來自血清型K2的ST86型菌株CG43中的質粒pLVPK，以及來自血清型K2的ST66型菌株Kp52.145中的質粒Kp52.145pⅡ(菌株也稱為52145或B5055；質粒也稱為pKP100)。普通肺炎克雷伯菌在獲得這些毒力質粒后，毒力顯著提升，主要是因為這些毒力質粒攜帶一些毒力相關基因，可使肺炎克雷伯菌具有毒力表型，如通過上調莢膜含量來賦予菌株黏液表型的rmpA基因、與鐵載體合成相關的iuc基因以及編碼重金屬抗性的基因座[17]。有研究對從不同肝膿腫患者體內分離到的40株高毒力肺炎克雷伯菌進行分析，均檢測到rmpA和iuc基因，且大多數菌株具有至少1個類似pK2044的質粒[18]。最近在一株K1 ST15型肺炎克雷伯菌基因中發現質粒pKp104014_1既具有IncFIBk型(與KpVP-1質粒同源)毒力質粒特征，又具有耐藥質粒IncFIIK特征，既攜帶碳青霉烯類耐藥基因又攜帶毒力基因[19]。這一兼具耐藥性及毒力的接合型質粒的出現，無疑將加劇肺炎克雷伯菌的臨床危害性。

2 前噬菌體

噬菌體基因組是大小為2～300 kb的單鏈或雙鏈DNA/RNA，通常編碼噬菌體成分和特定復制酶基因，在某些情況下還編碼細菌基因。由于基因組和形態特征不同，噬菌體之間存在廣泛差異。根據其生命周期，可以分為裂解性噬菌體或溫和性噬菌體。在裂解性周期中，噬菌體利用宿主系統復制并產生新的后代，然后從感染的細胞中釋放出來。溫和性噬菌體既可以通過裂解性周期繁殖，也可以通過將其基因組整合到宿主染色體中而進入溶原性周期[20]。在大多數溶原情況下，噬菌體將基因組整合到細菌染色體中并作為“前噬菌體”復制。但在少數情況下，噬菌體基因組可作為環狀或線性質粒自主復制[7]。噬菌體DNA作為可移動DNA元件，是細菌之間橫向基因轉移的載體[21]。噬菌體可以通過普遍性或局限性轉導進行基因交換，從而使噬菌體顆粒將遺傳特性從供體細菌細胞傳遞到受體細胞。實際上，細菌的許多毒力因子是由噬菌體編碼的[22]。噬菌體的這種作用不僅限于致病菌，非致病菌對環境的某些適應性也可能由噬菌體基因組介導[23]。

根據目前已完成測序的肺炎克雷伯菌基因組數據，發現92%的菌株中有前噬菌體基因組存在，但數量有較大差別，多者達20幾個，平均為5.4個。不同肺炎克雷伯菌克隆群甚至同一克隆群的不同菌株中前噬菌體數目也有很大差異。高毒力肺炎克雷伯菌與其他類型肺炎克雷伯菌株相比前噬菌體的數量無顯著差異，而耐藥肺炎克雷伯菌基因組中噬菌體的數量明顯高于其他類型，表明肺炎克雷伯菌特別是MDR肺炎克雷伯菌經常受到多種類型噬菌體的攻擊[24]。此外，肺炎克雷伯菌染色體的基因組大小與前噬菌體的總基因組大小正相關，表明前噬菌體是肺炎克雷伯菌的主要輔助基因之一，對其基因組的可塑性具有重大貢獻[25]。雖然肺炎克雷伯菌基因組中含有數量眾多的前噬菌體，但對前噬菌體功能的研究相對較少，推測其在肺炎克雷伯菌基因組進化及功能適應中發揮了一定的作用。目前發現，前噬菌體溶原性轉換可以使肺炎克雷伯菌獲得blaSHV、fosA和oqxAB等耐藥基因，同時前噬菌體FR2和AP3的溶原性轉換可以對肺炎克雷伯菌莢膜進行修飾，從而發生表型改變。

3 IS

IS是最小和最多的自主轉座元件(transposable element，TE)，位于轉座子兩端，在塑造宿主基因組中起重要作用。IS通常指一段短的DNA片段，僅編碼轉座有關的酶，可以整合到基因組導致細菌基因突變。IS可獨立存在，也可成為轉座子的一部分。典型的IS長度為0.7～2.5 kb，具有一個或兩個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，用于編碼轉座必需的轉座酶。這些ORF遺傳結構緊湊，占據IS整個長度，并終止于IS兩端的反向重復序列(inverted repeat，IR)[26]。IR 有兩個功能區，Ⅰ區位于 IS末端處，一般包括末端2～3個堿基，與轉座起始時的鏈切割和鏈轉移相關；Ⅱ區在IR內部，是轉座酶結合區域。根據轉座酶催化活性中心氨基酸序列的差異，可將轉座酶分為DDE轉座酶、DEDD轉座酶、HUH轉座酶和絲氨酸轉座酶，這是IS分類的主要依據。大多數 IS 的轉座酶為 DDE轉座酶[27]。IS兩側可能有因插入而生成的短正向重復序列(direct repeat，DR)。IS的DR長度不定，一般為2～14 bp，相同 IS可能會有不同DR，有的IS 也可能沒有DR。IS轉座時，可通過雙鏈切割和單鏈切割兩種機制完成。雙鏈切割后IS以線性方式游離，然后插入新位點；而單鏈切割后，有些 IS 以環形方式游離，在原位點可能留下一個拷貝，也可能因二次切割整體環出。有些 IS 還可能通過其他更復雜的方式復制轉座[28]。IS對細菌宿主的一個重要影響是其調節基因表達的能力，除了作為載體具有以復合轉座子和轉運蛋白的形式從一個復制子傳遞到另一個復制子以及中斷基因的能力外，還可激活基因表達。目前，由于細菌對各種抗生素的耐藥性增強，公共健康安全受到嚴重威脅，IS的這種能力受到了廣泛關注[29]。

對耐藥肺炎克雷伯菌ST258的基因組進行分析，發現其基因組中耐藥基因blaKPC通常包含Tn4401。Tn4401長10 kb，兩端有39 bp的IR，編碼blaKPC基因，具有Tn3轉座酶基因tnpA、Tn3解聚酶基因tnpR、兩個重復序列及ISKpn6和ISKpn7序列，被廣泛認為與blaKPC的獲得及轉移有關。在肺炎克雷伯菌質粒pKPN3、pKPN4和pKPN5中也發現了Tn4401序列，更進一步證實其與肺炎克雷伯菌基因組中遺傳成分特別是耐藥基因blaKPC的轉移相關[30-31]。Tn4401a-blaKPC-2位于肺炎克雷伯菌基因組中前噬菌體下游，但是否與前噬菌體整合有關尚未知。Anita等發現了一個新亞型Tn4401h，其在ISKpn7與blaKPC之間上游非編碼區有188 bp的缺失，與其他常見Tn4401亞型相比，這種缺失對碳青霉烯類抗生素的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)有影響，表明轉座子亞型對肺炎克雷伯菌的耐藥性有影響[32]。Tn1331也具有tnpA和tnpR基因，在IncN、IncI2 和IncFIA型質粒基因組中均被發現。Tn1331常攜帶耐藥基因aac(6′)-Ib和aadA1，以及blaOXA-9和blaTEM-1基因[33]。ISEcp1亦常在耐藥質粒基因中被發現，與blaCTX-M-15基因的插入及轉移有關。隨著研究不斷深入，還發現肺炎克雷伯菌基因組中很多耐藥基因的插入及獲得均與IS序列如IS1T、IS1R、IS26、ISKpn26、ISKpn28和In27等有關，而Tn6556常與前噬菌體的插入相關。

4 結語

肺炎克雷伯菌基因組具有高度變異性，可移動元件特別是質粒和噬菌體的獲得或丟失是導致基因組多樣性的主要原因。耐藥基因和毒力基因會與不同特征性的可移動元件一起，通過可移動元件進行轉移，這可能是導致肺炎克雷伯菌高耐藥性和高毒力不斷增強并流行的主要原因。近年來不斷發現同時攜帶高毒力及高耐藥性的接合型質粒，可在短時間內快速播散轉移，使肺炎克雷伯菌快速獲得高毒力和高耐藥性，給臨床治療帶來了巨大挑戰。因此，研究及關注不同可移動元件與耐藥基因及毒力基因的關系，并揭示其轉移特征及機制，對防控高毒力及高耐藥性肺炎克雷伯菌的出現及傳播有重要意義。