兩性霉素B抗真菌作用機(jī)制與病原性土曲霉對(duì)其耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

梁天宇，李若瑜，劉偉

北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，國(guó)家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034

侵襲性真菌病(invasive fungal disease, IFD)是一類(lèi)由真菌感染引起的死亡率較高的感染性疾病，多見(jiàn)于骨髓移植受者、實(shí)體器官移植受者、艾滋病患者等免疫功能受損的患者，其臨床預(yù)后有賴于早期診斷和有效的抗真菌藥物治療[1-2]。目前臨床上用于治療IFD的抗真菌藥物有唑類(lèi)、棘白菌素類(lèi)、多烯類(lèi)和氟胞嘧啶。其中，多烯類(lèi)抗真菌藥兩性霉素B(amphotericin B, AMB)自20世紀(jì)50年代問(wèn)世以來(lái)，盡管存在嚴(yán)重的腎毒性，但因其抗菌譜廣、耐藥性低，被廣泛用于治療曲霉、隱球菌、假絲酵母(念珠菌)、毛霉、球孢子菌等引起的侵襲性真菌感染(invasive fungal infections, IFIs)[3-4]。為克服其毒副作用，對(duì)AMB進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造并發(fā)展出了脂質(zhì)劑型的AMB[5-7]，目前已應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

病原性土曲霉對(duì)AMB天然耐藥[8]，新近還有耐AMB的構(gòu)巢曲霉和黃曲霉引起感染的報(bào)道[9-11]。既往認(rèn)為，AMB通過(guò)直接作用于真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇而引起膜通透性增加，最終發(fā)揮抗真菌作用，但詳細(xì)的作用機(jī)制仍然不清楚。最近有學(xué)者在土曲霉對(duì)AMB耐藥性方面進(jìn)行了系列研究[12-17]，提出了土曲霉對(duì)AMB耐藥的新機(jī)制，還對(duì)AMB在土曲霉中的作用機(jī)制提出新觀點(diǎn)[13]。這些研究雖然是針對(duì)土曲霉的，但對(duì)于認(rèn)識(shí)AMB在臨床上其他病原性曲霉中的作用機(jī)制和耐藥機(jī)制也具有重要的借鑒意義。本文針對(duì)這方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 AMB的殺菌作用機(jī)制

以往認(rèn)為，AMB通過(guò)特異性結(jié)合真菌細(xì)胞膜上重要的脂質(zhì)組分麥角固醇而嵌入細(xì)胞膜中，形成跨膜離子通道(離子通道模型)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、鉀離子外流發(fā)揮其殺菌活性[18-21]；進(jìn)一步研究認(rèn)為，AMB主要通過(guò)在細(xì)胞膜表面直接結(jié)合麥角固醇(表面吸附模型)，或通過(guò)聚合形成巨大的膜外聚合物(固醇海綿模型)、從膜磷脂雙分子層中吸附并綁定麥角固醇而發(fā)揮殺真菌作用，而跨膜離子通道的作用較小[22-23]；與此同時(shí)，AMB形成的膜外聚合物也結(jié)合人體細(xì)胞膜上的膽固醇，這是導(dǎo)致其毒性作用的主要原因[24]。最近研究揭示，AMB通過(guò)影響土曲霉線粒體呼吸鏈功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，引起細(xì)胞內(nèi)氧化損傷，從而發(fā)揮其抗真菌作用[25]。

1.1 真菌線粒體呼吸鏈結(jié)構(gòu)

真菌細(xì)胞中線粒體內(nèi)膜包含5個(gè)呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體[26-27](見(jiàn)圖1)。

圖1 真菌線粒體電子傳遞鏈模式圖(UQ：泛醌；UQH2：還原性泛醌)

復(fù)合體Ⅰ：還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH)-泛醌還原酶，由至少35個(gè)亞基構(gòu)成，其中7個(gè)主要亞基為線粒體基因編碼，其余附屬亞基為核基因編碼。這些亞基在線粒體內(nèi)膜上共同參與組裝構(gòu)成復(fù)合體Ⅰ并維持其穩(wěn)定，調(diào)控其活性。復(fù)合體Ⅰ催化NADH的電子傳遞給泛醌，并將質(zhì)子由線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體膜間隙中。

復(fù)合體Ⅱ：又稱琥珀酸-泛醌還原酶，由4個(gè)亞基構(gòu)成，均由核基因編碼，可氧化琥珀酸生成延胡索酸，并將電子傳遞給泛醌，但并不伴隨質(zhì)子轉(zhuǎn)移。

復(fù)合體Ⅲ：泛醌-細(xì)胞色素C還原酶，由10個(gè)亞基組成，其中1個(gè)為線粒體編碼，其余由核基因編碼，其作用是將泛醌攜帶的電子傳遞給細(xì)胞色素C。

復(fù)合體Ⅳ：細(xì)胞色素C氧化酶，由12個(gè)亞基組成，其中4個(gè)亞基為線粒體基因編碼，其余為核基因編碼，其作用是催化氧分子生成水。

復(fù)合體V：即三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)合成酶，由F0、F1子復(fù)合體構(gòu)成，其作用是利用復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度來(lái)合成ATP。

1.2 真菌呼吸鏈上的電子傳遞

來(lái)自NADH的電子經(jīng)由復(fù)合體Ⅰ傳遞給泛醌，來(lái)自琥珀酸的電子經(jīng)由復(fù)合體Ⅱ傳遞給泛醌，泛醌接受復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ的電子生成還原性泛醌，并繼續(xù)將電子傳遞給復(fù)合體Ⅲ，復(fù)合體Ⅲ上的電子經(jīng)由細(xì)胞色素C傳遞給復(fù)合體Ⅳ，進(jìn)一步將電子傳遞給氧分子，催化氧分子生成水。復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ在傳遞電子的同時(shí)，可將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵入膜間隙中，在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)梯度，復(fù)合體V利用這一質(zhì)子電化學(xué)梯度催化二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和無(wú)機(jī)磷酸生成ATP[28]。同時(shí)，復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ也是產(chǎn)生ROS的主要部位[29-30]。

除上述經(jīng)典呼吸鏈上的復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ外，土曲霉線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)中還存在一類(lèi)替代氧化酶(alternative oxidase, AOX)，包括AOX1和 AOX2，由核基因編碼。AOX位于線粒體內(nèi)膜，可繞過(guò)復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ而接受復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ傳遞給泛醌的電子，從而將氧還原為水，但較少生成ROS；這一替代氧化過(guò)程并不伴隨質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)移，因此較少產(chǎn)生ATP[27]。

真菌在高能量需求或指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，由經(jīng)典復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ途徑進(jìn)行電子傳遞，可產(chǎn)生大量ATP滿足生長(zhǎng)需要；而在低能量需求或穩(wěn)定生長(zhǎng)階段，則由AOX替代途徑進(jìn)行電子傳遞，生成水和極少量ATP，ROS生成也少[35-36]。

1.3 AMB對(duì)真菌線粒體呼吸鏈的作用

經(jīng)AMB作用的敏感土曲霉(susceptibleAspergillusterreus, ATS)產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性ROS，菌落生長(zhǎng)受到明顯抑制[12]，這種情況在對(duì)AMB敏感的煙曲霉[37]和念珠菌[38]中亦可見(jiàn)到；抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)為非特異性巰基供體，可清除ROS，發(fā)揮抗氧化作用[39]；聯(lián)合使用NAC和AMB可降低內(nèi)源性ROS累積水平，并使AMB對(duì)ATS的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)升高，提示AMB通過(guò)引起ATS產(chǎn)生內(nèi)源性ROS而發(fā)揮抗真菌作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AMB作用的ATS中，分別以ndufs1(復(fù)合體Ⅰ亞基)、sdhc(復(fù)合體Ⅱ亞基)、cytc1(復(fù)合體Ⅲ亞基)、cox15(復(fù)合體Ⅳ亞基)基因的轉(zhuǎn)錄水平代表的復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ表達(dá)水平均明顯增加，表明AMB可以促進(jìn)復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ的表達(dá)，增強(qiáng)線粒體呼吸鏈的功能。利用抑制劑萎銹靈(復(fù)合體Ⅱ抑制劑)、抗霉素A(復(fù)合體Ⅲ抑制劑)、氰化鉀(復(fù)合體Ⅳ抑制劑)分別抑制復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時(shí)，并未影響ATS對(duì)AMB的敏感性，但利用魚(yú)藤酮(復(fù)合體Ⅰ抑制劑)抑制復(fù)合體Ⅰ后可使AMB的MIC升高[12]，AMB引起的內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生明顯降低。

綜上所述，AMB可增強(qiáng)線粒體復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的功能，并通過(guò)增強(qiáng)復(fù)合體Ⅰ的功能促進(jìn)內(nèi)源性ROS產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗真菌作用。

2 病原真菌對(duì)AMB的耐藥機(jī)制

2.1 麥角固醇合成途徑中基因的作用

已報(bào)道白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌、土曲霉、黃曲霉、煙曲霉等對(duì)AMB可產(chǎn)生耐藥性[3]。在酵母菌中，麥角固醇合成途徑中的一系列基因的缺失或突變(包括erg1、erg2、erg3、erg4、erg6和erg11等)[40]可影響細(xì)胞膜上固醇類(lèi)的生物合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜上麥角固醇含量減少，由于缺乏可替代的中間產(chǎn)物供AMB靶向結(jié)合，從而導(dǎo)致對(duì)AMB耐藥[3]。譬如，Vincent等[41]通過(guò)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，臨床分離的耐AMB的白念珠菌存在erg2或erg6突變，熱帶念珠菌存在erg3和erg11雙突變，通過(guò)分別構(gòu)建上述基因定向敲除菌株，證明上述erg基因突變可導(dǎo)致對(duì)AMB耐藥。

但是，Blum等[13-14]發(fā)現(xiàn)臨床分離的ATS、AMB天然耐藥株(resistantAspergillusterreus, ATR)及對(duì)AMB敏感的煙曲霉(susceptibleAspergillusfumigatus, AFS)菌株細(xì)胞膜麥角固醇的含量并無(wú)差異，提示土曲霉對(duì)AMB耐藥的機(jī)制與麥角固醇含量無(wú)關(guān)，與上述酵母菌中的情況不同。

2.2 熱休克蛋白的作用

熱休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的進(jìn)化上高度保守的分子伴侶蛋白，由N端結(jié)構(gòu)域(amino-terminal domain, NTD)、中間結(jié)構(gòu)域(middle domain, MD)、C端結(jié)構(gòu)域(carboxy-terminal domain, CTD)及MEEVD(Met-Glu-Glu-Val-Asp)基序組成，其中：NTD負(fù)責(zé)結(jié)合ATP；MD負(fù)責(zé)結(jié)合客戶蛋白(client proteins)并幫助后者正確折疊，形成成熟、穩(wěn)定的構(gòu)象；CTD負(fù)責(zé)形成Hsp90二聚體；而MEEVD基序則主要結(jié)合共伴侶分子(co-chaperones)，后者可以輔助客戶蛋白的正確折疊。在釀酒酵母中，Hsp90可以與約10%的蛋白相互作用[42-43]，通過(guò)調(diào)節(jié)其客戶蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、激酶及其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟和降解，從而廣泛參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)以及適應(yīng)性表型的產(chǎn)生和維持[43]。

Hsp90可通過(guò)MD結(jié)構(gòu)域直接與其客戶蛋白鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)的催化亞單位相互作用，幫助后者維持構(gòu)象穩(wěn)定。鈣調(diào)磷酸酶是一種Ca2+-鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在菌絲生長(zhǎng)、刺激適應(yīng)、菌核和附著孢發(fā)育及胞壁完整性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[44-45]。在大多數(shù)絲狀真菌中[46-48]，鈣調(diào)磷酸酶是由一個(gè)催化亞基CnA和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基CnB構(gòu)成的異二聚體，CnA亞基包含催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain)、 CnB結(jié)合域(CnB binding domain)、 CaM結(jié)合域(CaM binding domain)和自身抑制域(auto-inhibitory domain, AID)共4個(gè)結(jié)構(gòu)域；CnB亞基是一種Ca2+結(jié)合蛋白，結(jié)合Ca2+后可形成緊密構(gòu)象，引起CnA亞基中AID及催化結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化和活性位點(diǎn)暴露，幫助其發(fā)揮催化功能。

Cowen等[49]證明Hsp90通過(guò)快速選擇機(jī)制，在多種真菌耐藥突變及表型的產(chǎn)生和維持過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但不同種的真菌影響的藥物種類(lèi)不同：抑制Hsp90或calcineurin可明顯降低由臨床分離的白念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥性，但其對(duì)卡泊芬凈的敏感性無(wú)明顯影響；相反，抑制Hsp90或calcineurin可明顯降低土壤中分離的土曲霉菌株對(duì)卡泊芬凈的耐藥性，但并未影響其對(duì)氟康唑的耐藥性。在體外，Hsp90抑制劑格爾德霉素(geldanamycin)或其衍生物17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG)與AMB具有協(xié)同作用，可顯著降低 AMB 對(duì) ATR 的MIC；AMB與鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A聯(lián)用也具有相似的作用；與AFS相比，ATR和ATS具有更高的Hsp90基礎(chǔ)表達(dá)水平，這一點(diǎn)可能使土曲霉對(duì)AMB引起的細(xì)胞膜應(yīng)激和環(huán)境變化具有更強(qiáng)的適應(yīng)性[15]，說(shuō)明Hsp90或鈣調(diào)磷酸酶活性增強(qiáng)促進(jìn)了土曲霉對(duì)AMB所致應(yīng)激的適應(yīng)性。

熱休克蛋白70(heat shock protein 70, Hsp70)家族是另一類(lèi)與Hsp90共同組成細(xì)胞內(nèi)監(jiān)視網(wǎng)絡(luò)的分子伴侶，除古生菌外在所有物種中高度保守，其家族成員N端均含有高度保守的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)及位于C端的序列多變的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域[16]。相比于Hsp90，Hsp70的靶蛋白更加龐雜，且可以與未折疊、錯(cuò)誤折疊及相互聚集的底物蛋白相互作用，幫助其正確折疊并維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[50]。當(dāng)體外暴露于AMB的ATR中，Hsp70家族成員ssa和ssb的量在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均顯著升高；利用抑制劑pifithrin-μ抑制Hsp70后，AMB對(duì)ATR的MIC明顯降低(從≥32 μg/mL降至 ≤1 μg/mL)；聯(lián)合使用AMB和pifithrin-μ治療感染ATR的大蠟螟，可改善療效，提高生存率[16]，也證實(shí)了這種協(xié)同作用。 Hsp70活性增強(qiáng)，可促進(jìn)AMB的耐藥性；而抑制Hsp70活性可作為治療ATR引起侵襲性曲霉病的潛在研究方向。

2.3 線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)的作用

比較ATS和ATR時(shí)發(fā)現(xiàn)：未暴露于AMB時(shí)，ATS的基礎(chǔ)耗氧速率是ATR的3.3倍，其線粒體拷貝數(shù)更高(高約23%)，生長(zhǎng)速度更快[12]，毒力更強(qiáng)[51-52]，這與敏感菌株生長(zhǎng)快、毒力強(qiáng)的描述是一致的[41]；暴露于AMB時(shí)，ATS的線粒體拷貝數(shù)進(jìn)一步增加，內(nèi)源性ROS大量產(chǎn)生，而ATR的線粒體拷貝數(shù)進(jìn)一步減少，內(nèi)源性ROS產(chǎn)生水平更低[12]。由于線粒體拷貝數(shù)的多寡與線粒體呼吸鏈活性高低一致，因此當(dāng)ATR中線粒體拷貝數(shù)減少時(shí)，其耗氧速率降低，相應(yīng)地內(nèi)源性ROS生成減少，從而導(dǎo)致耐藥性增強(qiáng)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[12]，暴露于AMB的ATS線粒體復(fù)合體Ⅰ表達(dá)水平顯著升高，aox表達(dá)水平輕度升高，ROS的生成增多；暴露于AMB的ATR的線粒體復(fù)合體Ⅰ表達(dá)水平僅輕度升高，而AOX表達(dá)水平顯著升高，ROS的生成相對(duì)減少。如前所述，復(fù)合體Ⅰ活性的降低可減少ATS中ROS的生成，AOX高表達(dá)也可能參與抑制ROS生成[35-36]；進(jìn)一步利用水楊羥肟酸(salicylhydroxamic acid, SHAM)抑制ATR中AOX的活性，則內(nèi)源性ROS水平明顯增加、AMB的MIC明顯下降[12]，再次提示AOX的高表達(dá)可導(dǎo)致ATR中ROS生成減少，產(chǎn)生耐藥性，因此AOX可作為抗真菌藥物的潛在靶點(diǎn)。

總之，AMB通過(guò)增強(qiáng)呼吸鏈經(jīng)典途徑中線粒體復(fù)合體Ⅰ的功能而促進(jìn)真菌細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，最終發(fā)揮抗真菌作用。暴露于AMB的ATR中，呼吸鏈經(jīng)典途徑中線粒體復(fù)合體Ⅰ表達(dá)水平僅輕度升高，不及ATS中顯著；而替代途徑AOX功能顯著增強(qiáng)，內(nèi)源性ROS生成相對(duì)減少，最終產(chǎn)生耐藥性。

2.4 ROS清除系統(tǒng)的作用

ROS是真核細(xì)胞呼吸鏈過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，及時(shí)清除ROS對(duì)于維持其正常的生命活動(dòng)具有重要作用。真核細(xì)胞中存在多種ROS 清除系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)等。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源性ROS生成增多引起氧化應(yīng)激時(shí)，可誘導(dǎo)上述ROS清除酶的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷[26]。

研究表明，未暴露于AMB時(shí)[52]，ATR中SOD的活性約為ATS中的2倍，而CAT 表達(dá)水平無(wú)明顯差異，說(shuō)明ATR較ATS清除ROS的能力更強(qiáng)；暴露于AMB后，ATS中SOD和CAT的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但在ATR中均明顯增加，說(shuō)明AMB可促使ATR增強(qiáng)對(duì)ROS的清除能力。利用抑制劑N,N-二甲基二硫代氨基甲酸(N-N-diethyldithiocarbamate, DDC)和3-氨基-1,2,4-三氮唑(3-amino-1,2,4-triazole, 3-AT)分別抑制SOD和CAT的活性，均可使ATR中內(nèi)源性ROS水平明顯增加，AMB的MIC降至敏感水平；且在ATS中，抑制SOD或CAT可使AMB的MIC進(jìn)一步降低。總之，ATR中SOD和CAT活性增強(qiáng)，可快速清除內(nèi)源性ROS，是ATR對(duì)AMB耐藥的可能機(jī)制之一；且抑制真菌SOD和CAT活性，可作為潛在的抗真菌治療靶點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

如圖2總結(jié)所示，AMB的抗真菌作用機(jī)制包括：①AMB直接結(jié)合真菌細(xì)胞膜麥角固醇和(或)形成細(xì)胞膜離子通道，破壞真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，影響細(xì)胞內(nèi)外離子水平和滲透壓改變；②AMB增加土曲霉線粒體拷貝數(shù)，增強(qiáng)線粒體呼吸鏈經(jīng)典途徑中復(fù)合體Ⅰ的活性，產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性ROS，從而引起真菌細(xì)胞的氧化損傷。

圖2 AMB抗真菌作用機(jī)制和耐藥機(jī)制(紅色箭頭代表作用機(jī)制，藍(lán)色箭頭代表耐藥機(jī)制)

病原真菌對(duì)AMB的耐藥機(jī)制包括：①酵母中麥角固醇合成途徑基因突變或缺失，導(dǎo)致細(xì)胞膜麥角固醇含量減少而使靶向結(jié)合物缺乏；②土曲霉中分子伴侶Hsp90、鈣調(diào)磷酸酶及Hsp70的活性升高，增強(qiáng)了其對(duì)AMB所致應(yīng)激的適應(yīng)性；③土曲霉線粒體拷貝數(shù)減少，耗氧速率降低，內(nèi)源性ROS生成減少；④土曲霉經(jīng)AMB作用后，呼吸鏈經(jīng)典途徑中線粒體復(fù)合體Ⅰ活性無(wú)顯著升高，同時(shí)替代途徑AOX功能顯著增強(qiáng)，內(nèi)源性ROS生成減少；⑤土曲霉ROS清除酶CAT、SOD活性增強(qiáng)所致的內(nèi)源性ROS清除增強(qiáng)。