N-myc下游調控基因1在肝細胞癌中的表達及其與預后的相關性

郭晶晶，徐瀚峰，朱傳東，繆 祎，鄭 勤

0 引 言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌中最常見的一種惡性腫瘤。在全球范圍內，肝細胞癌是第六大最常見的癌癥和第四大癌癥死亡原因[1]。2018年，肝癌發病人數約為84.1萬人，死亡人數為782 000人[1]。遺憾的是，由于早期發現困難，復發率高，目前對于大多數確診為中晚期的HCC患者尚無有效的治療方法。因此，探索可靠的HCC生物標志物對早期診斷和預后尤為重要。N-myc下游調控基因1(N-myc downstream regulatory gene1，NDRG1)是NDRG家族的基因之一，在不同的腫瘤類型中表現出不同的抗腫瘤或致癌作用[2]。有研究表明，NDRG1作為抑癌基因在前列腺癌、胰腺癌和結直腸癌中低表達[3-5]。相反，有報道稱NDRG1在胃癌、宮頸癌、腎癌、鱗狀細胞癌等多種癌癥中過表達，提示其具有致瘤作用[6-10]。NDRG1在肝癌中的表達目前存在爭議。有研究認為NDRG1在肝癌中高表達，NDRG1表達增加可促進體外肝細胞癌和肝癌細胞的增殖和侵襲，促進腫瘤生長和血管生成，促進了肝癌的發展[11-13]。但是其他一些研究人員認為NDRG1作為抑癌基因在肝癌組織中低表達，抑制肝癌的發展[14-15]。本研究旨在探討NDRG1在肝癌組織和正常肝組織中的表達，探討NDRG1在肝癌發生發展中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 數據收集從TCGA (The Cancer Genome Atlas) (https://portal.gdc.cancer.gov/repository)公共數據庫下載mRNA表達數據(465例，包括58例正常肝組織標本和407例肝癌標本)及與之相應的臨床信息。

1.2 NDRG1在正常肝組織和肝癌組織中的表達及其與臨床因素相關性分析407例肝癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、臨床分期、組織學分級、淋巴結轉移(TNM)分級、生存狀況和生存時間。使用R語言軟件(R 3.6.3)，采用Limma包檢測NDRG1在407例肝癌患者和58例正常肝組織中的表達。使用beeswarm包對407例肝癌患者和58例正常肝組織的NDRG1表達進行了可視化。根據NDRG1表達的中位數，將所有患者分為NDRG1低表達組和NDRG1高表達組。使用survival包分析NDRG1低表達組和NDRG1高表達組的生存情況。使用logistic回歸分析NDRG1表達與臨床因素(年齡、性別、分期、分級、遠處轉移狀態、淋巴結狀態、組織學分級)的相關性。

1.3 基因集富集分析(gene set enrichment analysis， GSEA)使用GSEA軟件，上傳407例肝癌組織中的NDRG1表達文件，比較NDRG1高表達和NDRG1低表達的數據集，依據功能基因集數據庫，選擇京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路，篩選HCC中潛在信號通路，發現可能的信號通路，探討NDRG1的生物學功能。富集結果必須滿足兩個條件:錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05和P<0.05。

1.4 浸潤免疫分析利用TIMER網站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)在線研究NDRG1表達與肝癌免疫浸潤細胞的關系，得到NDRG1在HCC中的表達與CD4+T細胞、樹突狀細胞、B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞的相關性。應用CIBERSORT(http://cibersort.stanford.edu/)評估HCC中不同免疫浸潤細胞與NDRG1表達的關系，并揭示免疫細胞之間的相關性。將407例腫瘤標本分為NDRG1高表達組和NDRG1低表達組，觀察2組免疫浸潤細胞表達的差異。

1.5 使用Human Protein Atlas (HPA)數據庫驗證NDRG1蛋白表達為進一步檢測NDRG1蛋白的表達，使用來自HPA公共數據庫(http://www.proteinatlas.org/)的免疫組織化學(IHC)數據，對HPA中NDRG1蛋白在肝正常組織切片和肝癌組織切片中的免疫組化染色結果進行檢索。比較NDRG1在正常肝組織和HCC組織中的蛋白表達。

1.6 使用基因型組織表達(GTEx)數據庫顯示NDRG1在人類肝組織中的表達GTEx數據庫是一種包含人體各種器官遺傳信息的工具。GTEx數據庫包含了來自44個組織的7000多份尸檢樣本的基因表達。使用GTEX數據庫(https://www.gtexportal.org/home/)，以發現NDRG1在正常人體組織中的表達水平。

1.7 統計學分析采用SPSS 22.0和R 3.6.3進行統計分析。使用R軟件對NDRG1在TCGA數據集中的表達采用單因素Cox分析和多因素Cox分析。使用Wilcoxon符號秩檢驗和logistic回歸比較TCGA數據集中肝癌樣本的臨床特征和NDRG1的表達的相關性。總體生存分析采用Kaplan-Meier法進行雙側對數秩檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NDRG1在肝癌中的表達及臨床病理因素與正常組織相比，肝癌組織中NDRG1表達增加(P<0.001)。NDRG1表達與組織學分級(G)(P<0.001)、臨床S分期(P=0.03)、臨床T分期(P=0.018)呈正相關。采用logistic回歸分析顯示NDRG1表達與臨床病理不良預后相關。NDRG1在肝細胞癌的高表達與組織學分級(G)顯著相關(G3vsG1：OR=2.072，95%CI=1.091～3.992，P=0.027；G4vsG1：OR=6.957，95%CI=1.640～48.134，P=0.018)、臨床分期(S)顯著相關(ⅢvsⅠ：OR=1.832，95%CI=1.095～3.095，P=0.0221)和臨床T分期顯著相關(T3vsT1：OR=1.908，95%CI=1.142～3.224，P=0.0145)。見表1，圖1。提示NDRG1高表達對應臨床分期較差，預后較差。HPA數據庫中檢索發現在正常肝組織中，NDRG1蛋白低表達，而在HCC組織中NDRG1蛋白高表達。

表1 肝細胞癌中NDRG1表達與臨床病理特征相關性

a:在正常肝組織和肝癌組織的表達；b:在正常肝組織及其相對應肝癌組織的表達；c:年齡；d:性別；e:G分級；f:S分期；g:T分期；h:M分期；i:N分期圖1 NDRG1在肝細胞癌中的表達與臨床因素相關性

2.2 NDRG1在正常肝組織中的表達使用GTEx數據資料，發現NDRG1在不同組織中的表達不同，相比較其他正常組織，正常肝組織中NDRG1表達較低。

2.3 NDRG1表達與生存結果相關性及其單因素、多因素分析NDRG1的高表達與較差的總生存率顯著相關(P=0.005)，見圖2。單因素Cox分析顯示，NDRG1高表達與較差的總生存率顯著相關(HR=1.012，95%CI=1.008～1.015，P<0.001)。不良生存相關的臨床病理的特點包括S分期(HR=1.865，95%CI=1.456～2.388，P<0.001)，T分期(HR=3.850,95%CI=1.207～12.281,P=0.0228)和M分期(HR=3.850，95%CI=1.207～12.281，P=0.0228)。多因素Cox分析表明,高NDRG1表達是獨立危險因素，與肝細胞癌患者的總生存期密切相關(HR=1.010,95%CI=1.006～1.014，P<0.001)。見表2。

圖2 NDRG1在肝細胞癌患者中的表達與總生存率

2.4 GSEA識別NDRG1相關的信號通路GSEA顯示了在豐富MSigDB集合方面的顯著差異(h.all.v6.2.symbols.gmt)，FDR-q<0.25和P<0.05的基因組顯著富集。根據標準化的富集分數，確定最顯著的富集信號通路。NDRG1高表達與DNA修復、E2F、G2M檢查點、MYC-V1、P53通路、TGF-β通路等相關。見圖3。

表2 NDRG1表達與肝細胞癌患者生存結果的單因素Cox分析和多因素Cox分析

2.5 NDRG1表達與腫瘤浸潤免疫細胞的關系NDRG1表達與B細胞(P=2.33×10-9)、CD4+T細胞(P=2.68×10-5)、巨噬細胞(P=3.95×10-12)和樹突狀細胞(P=1.98×10-9)相關。與NDRG1低表達組相比，高表達組單核細胞和M0巨噬細胞升高(P<0.05)。見圖4。

a:DNA修復；b:E2F通路；c:G2M檢查點；d:MYC-V1通路；e:P53通路；f:TGF-β通路圖3 基因集富集分析

a：與免疫細胞的相關性；b：NDRG1高、低表達組的免疫細胞水平圖4 肝細胞癌中NDRG1表達與腫瘤浸潤免疫細胞的關系

3 討 論

NDRG1是一個與細胞分化相關的基因，屬于NDRG家族。該基因編碼的蛋白質是一種細胞質蛋白，參與應激反應、激素反應、細胞生長和分化[16]。在前列腺癌、結直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中下調表達是一種轉移抑制劑，可以抑制血管生成、細胞增殖和侵襲[17-19]。在肺癌、胃癌等惡性腫瘤中，表達上調并有致瘤作用[20-21]。NDRG1對癌癥患者的預后影響也不一致[22-23]。大多數關于NDRG1與肝癌關系的研究傾向于該基因在肝癌組織中的表達增加，在正常肝組織中的表達降低。該基因參與腫瘤的發展，但它抑制或促進腫瘤的發展仍存在爭議。

本研究結果顯示，NDRG1在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝組織，且NDRG1的表達水平在臨床病理分級、TNM臨床分期、肝癌患者生存時間等方面均有統計學意義。GTEx數據庫的正常人類數據顯示，NDRG1在肝中低表達。HPA數據顯示NDRG1蛋白在肝癌組織中表達量高，在正常肝組織中表達量低。兩者都表明NDRG1可能在肝細胞癌的發展中發揮潛在的癌基因作用。目前NDRG1可能的致癌信號機制主要包括AKT、EGF、ErbB、Wnt/β-catenin、MAPK、jak-stat等途徑[24-27]。本研究通過GSEA富集分析發現其主要信號通路為E2F、MYC、G2M、pik-Akt、P53、TGF-β。本研究驗證了NDRG1在肝癌中的高表達，發揮促進肝癌發生發展的作用，與多數文獻報道相一致。提示NDRG1可作為肝癌診斷和預后的潛在預后標志物。但本研究局限于利用公共數據庫進行分析，還需要進一步的實驗進行驗證。對于其致癌信號通路研究只限于生物信息學研究，還需要進一步的實驗室研究。

肝細胞癌是原發性肝癌的主要組織學類型，對于不能手術的中晚期患者，放化療及介入治療為可選的治療方法，但預后較差。腫瘤免疫治療是新的治療手段，張南征等[28]采用細胞因子誘導的殺傷性細胞(cytokine induced killer cells,CIK)聯合介入治療中晚期肝細胞肝癌，有效率優于單純介入治療，延長了患者的生存期。

腫瘤微環境中免疫細胞的組成與預后有關。腫瘤新抗原在抗腫瘤免疫反應和預測免疫治療的臨床反應中發揮重要作用[29]。M2巨噬細胞和M1巨噬細胞與腫瘤的生長和擴散以及免疫抑制微環境的形成有關[30-31]。有研究表明，在結腸癌組織中，M0巨噬細胞，M1巨噬細胞和CD4記憶激活的T細胞浸潤明顯更多。M0巨噬細胞在N1期腫瘤中最高，提示M0巨噬細胞可能促進腫瘤生長發展[32]。另一項對于865例HCC患者的研究表明，生存率較差的高危組中巨噬細胞M0的比例高于低風險組，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受體-1(programmed cell death-1,PD-1)和T細胞免疫球蛋白黏連蛋白-3(T cell immunoglobulin mucin molecule 3,TIM-3)的表達也高于低風險組[33]。本研究發現NDRG1與M0巨噬細胞呈正相關，在腫瘤組織中高表達，與M0巨噬細胞促進腫瘤發生發展的作用相一致，提示其可能通過M0巨噬細胞參與腫瘤微環境，促進肝癌的發生發展。目前對于M0巨噬細胞在肝癌微環境中的作用相關研究很少，需要進一步實驗驗證。本研究推測M0巨噬細胞可能成為未來肝癌免疫治療的新靶點。是否可以通過調控NDRG1表達進而影響M0巨噬細胞在腫瘤微環境中的比例，從而達到抑制肝癌發展的作用，需要進一步研究。