溫陽散纖湯對博來霉素誘導的小鼠肺間質纖維化的保護作用

朱曉龍，邱念念，狐啟貴

（貴州中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科，貴州 貴陽 550001）

特發性間質肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種由多種原因引發的以兩肺彌漫性間質纖維化為特征的疾病，導致患者彌散功能降低，最終心肺功能衰竭致死[1]。IPF發病率呈上升趨勢，且致死率高，無有效根治措施，成為全球共同關注的醫學熱點問題。祖國醫學將IPF歸為“肺痹”“肺痿”范疇，認為其為本虛標實之證，痰濁、瘀血為其病理因素[2-3]。有研究顯示，以溫陽為主治療IPF療效顯著[4]，本研究探討溫陽散纖湯對博來霉素誘導的小鼠肺間質纖維化的保護作用，旨在為臨床治療特發性間質肺纖維化提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 105 只C57BL/6 小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 實驗試劑與儀器 溫陽散纖湯（廣東一方制藥有限公司，批號：0139573621629）；鹽酸博來霉素（北京索萊寶科技有限公司，批號：801G023）；甲基潑尼松龍（MACKLIN，批號：C10125981）；顯微鏡(CX41，OLYMPUS)。

1.3 動物造模、分組及給藥[5]75只小鼠制作成實驗模型：小鼠4%水合氯醛麻醉后，取仰臥位固定于操作臺上，頸部剃毛并用碘氟消毒后，沿頸部正中做1 cm切口，鈍性分離氣管前組織暴露氣管，然后迅速向小鼠氣管內注入5 mg/kg博來霉素0.2～0.3 mL，注射后使小鼠直立并左右旋轉，以使博來霉素在肺組織內均勻分布，最后在無菌條件下縫合皮膚。另取15只小鼠以同樣方法向氣管內注入0.3 mL 0.9%氯化鈉溶液溶液，為假手術組。將造模成功小鼠隨機分為5 組，即模型組，“溫陽散纖湯”低、中、高劑量組，陽性組，另外設正常對照組（無任何外界刺激處理），每組15 只。溫陽散纖湯組在造模后第2天，每天以5.663、11.325、22.650 g生藥/kg小鼠體質量灌胃，陽性組以甲強龍15 mg/kg小鼠體重腹腔注射，每天1次，共4周。正常對照組、假手術組及模型組灌以等體積的0.9%氯化鈉溶液，每天1 次，共4 周。實驗結束后取小鼠左肺組織用于HE染色實驗。

1.4 HE 染色 取出組織流水沖洗數小時，經70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置15 min（至透明為止）。石蠟包埋，切片。將石蠟切片進行烤片，然后脫蠟，水化。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍液返藍15 s，流水沖洗，伊紅染色，流水沖洗，脫水，透明，中性樹脂封片，鏡檢。

2 結果

2.1 模型建造并分組取樣 C57BL/6肺間質纖維化小鼠模型構建成，見圖1。

圖1 小鼠造模圖Figure 1 Model drawing of mice

2.2 HE 染色檢測各組小鼠肺組織病理變化 正常組小鼠肺間隔正常，無炎癥因子浸潤；假手術組小鼠肺組織結構與正常組類似；模型組小鼠肺間隔增寬，肺泡結構被破壞、肺泡炎癥明顯，大片炎癥細胞浸潤；溫陽散纖湯低、中、高劑量組小鼠肺間隔厚度有所改善，炎癥反應減弱，肺泡結構較為完整；陽性組小鼠結構肺間隔厚度正常，肺泡結構完整度較好，炎性細胞浸潤程度低，見圖2。

3 討論

圖2 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，×200）Figure 2 Pathological changes of lung tissue in each group(He staining,×200)

中醫藥能有效改善IPF 患者臨床癥狀，降低患者死亡率，并提高患者生存質量。溫陽散纖湯是本研究的臨床經驗方，以補骨脂、熟地黃、黃精、淫羊藿、黃芪、麥冬為主方，具有補益肺腎，扶正固本，養陰生津之功效，再佐以川芎丹、參當、歸地龍，兼具活血化瘀通脈之療效，諸藥合用，共奏益肺活血、納氣平喘，扶正祛邪之功效。以往研究顯示，此方劑中單藥對肺纖維化具有顯著改善作用，如黃芪甲苷可通過降低VEGF、VEGFR2 基因表達水平，發揮抗肺纖維化作用[6]。黃芪糖蛋白抑制小鼠肺纖維化的發展，其作用機制可能與降低肺組織中TGF-β1表達有關[7]。地龍可通過與靶蛋白TGF-β1結合從而抑制α-SMA 的表達以延緩肺纖維化進程[8]。地龍通過抑制NF-κB 活性，下調TGF-β1 表達，抑制膠原合成進而抑制博來霉素誘導的大鼠IPF[9]。丹參酮ⅡA通過iNOS通路調控下游炎性因子釋放，從而緩解小鼠肺纖維化[10]。提示復方中藥對于IPF小鼠具有改善作用。

IPF主要經歷3個階段：早期機體啟動炎癥/免疫反應階段，多種致病因素損害肺泡上皮細胞及血管內皮細胞；中期階段，多種炎癥細胞浸潤并釋放大量炎癥因子，加重組織損傷，并引發肺間質增生；晚期階段，大量成纖維細胞生成、膠原聚集、細胞外基質代謝紊亂并以反饋形式加重炎癥反應，導致肺泡正常結構功能被異常的修復重建。

綜上所述，抑制肺組織炎癥反應對于肺纖維化的改善具有重要意義，溫陽散纖湯能顯著抑制肺組織炎癥反應，進而改善IPF小鼠肺組織結構與功能。