鈦鉭生物梯度材料在成骨過程中對堿性磷酸酶的影響

姜銘坤，何亞茹，吳文慧

（1.華北理工大學口腔醫學院，河北 唐山 063000；2.唐山職業技術學院，河北 唐山 063000）

隨著人們對生活質量要求的提高和醫療科技的高速發展，生物材料領域受到廣泛重視。鈦及鈦合金材料具有力學性能良好、彈性模量低、易加工、抗腐蝕和生物相容性高等優點，被廣泛的應用于人工骨、人工關節、骨釘、牙種植體等硬組織替代材料和心臟瓣膜、血管支架等血管材料[1]。有研究發現，材料植入體內后，會與骨組織結合[2]。由于鈦表面存在氧化層，限制其與骨組織間形成理想的結合而具有生物惰性，影響植入體在體內的長期性；同時，復雜的人體內環境會腐蝕金屬材料從而導致有毒元素釋放[3]，生物相容性降低。因此，可在保留其原有優點的前提下，對鈦及鈦合金進行表面改性，有利于提高其多種性能，如生物相容性、抗菌性等，改善植入體的功效，延長植入體的使用壽命。

骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是從哺乳動物的骨髓基質中發現的一種可分化形成骨、軟骨、脂肪、神經及成肌細胞的細胞亞群，研究其成骨方向的分化有重要意義。目前，BMSCs成骨分化的檢測指標有多種，其中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織中的一種酶，在成骨過程中成骨細胞的活性增強時會分泌大量的ALP，是觀察成骨情況最直觀、有效的檢測指標之一[4]。基于此，本研究選取光滑鈦片、經酸蝕水熱處理的鈦片、經酸蝕水熱處理后等離子噴涂鉭的鈦片作為研究對象，旨在探討鈦鉭生物梯度材料在成骨過程中對堿性磷酸酶的影響，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取光滑鈦片（光滑純鈦組）、經酸蝕水熱處理的鈦片（酸蝕水熱組）、經酸蝕水熱處理后等離子噴涂鉭的鈦片（鉭噴涂組）作為研究對象，其中鉭噴涂組作為實驗組，光滑純鈦組、酸蝕水熱組作為對照組，上述材料均由華北理工大學材料學院提供。

1.2 主要試劑和儀器 SD 大鼠第三代BMSCs（華北理工大學口腔醫學院實驗室提供），磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司），ALP 試劑盒（南京建成），細胞培養箱（Forma，美國），低速離心機（SC—3610，安徽），平底24、96 孔培養板（Corning，美國），酶標儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.3 方法 將3 組鈦片置于24 孔板中，每組設3 個復孔，細胞接種密度為2×104/孔。培養3、5、7 d 后，收集上清液，12 000 r/min離心15 min，取上清液并采用ALP試劑盒進行檢測。①標準曲線繪制：試劑盒中的酶標準品貯備液用雙蒸水稀釋，分別稀釋 50 倍、20 倍、10 倍、5 倍、2.5 倍、5/3倍和1.25 倍，每孔5 μL。加入緩沖液、基質液及顯色劑250 μL，反應15 min后使用酶標儀在520 nm下檢測OD值，繪制ALP標準曲線備用。②測定各組ALP活性：實驗組于96孔板中每孔加入30 μL上清液，并加入緩沖液、基質液和顯色劑共250 μL；空白組加入30 μL 雙蒸水，并加入緩沖液、基質液和顯色劑共250 μL。反應30 min 后酶標儀以波長520 nm下測定OD值，根據標準曲線計算ALP的含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“”表示，采用單因素方差分析，組間比較采用F檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

第3 天，鉭噴涂組與酸蝕水熱組ALP 水平均明顯高于光滑純鈦組；第5 天，鉭噴涂組ALP 水平高于酸蝕水熱組；第7天，酸蝕水熱組與鉭噴涂組ALP 水平差異縮小，但鉭噴涂組仍高于酸蝕水熱組（P＜0.05），見表1。

表1 試件表面細胞ALP活性（金氏單位/100 mL）Table 1 Surface cell ALP activity(Kim's unit/100 mL)

3 討論

骨髓間充質干細胞具有自我更新和多向分化的潛能，可向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等細胞分化[5]。實驗研究表明，BMSCs 經成骨誘導后，復合以適當的材料能異位成骨、修復骨缺損，且不存在免疫排斥反應，是具有廣闊應用前景的種子細胞[6]。目前，BMSCs 成骨分化的檢測指標有多種，其分化形成的成骨細胞分泌一種糖蛋白，即堿性磷酸酶是早期礦化的標志，通過檢測ALP 的活性，可反映不同鈦片材料對成骨分化的影響。

純鈦應用于口腔種植體時，具有良好的生物相容性、抗腐蝕性等優點，但也存在生物活性較低、骨整合周期長等不足。因此，人們對其進行改性處理，為提高純鈦表面的生物活性，縮短骨整合周期[7]。上述方法涉及物理、化學、生物化學等幾大學科，具體有噴涂、大顆粒噴砂酸蝕（SLA）、等離子噴涂、濺射、離子注入、激光處理、紫外線處理、酸蝕處理、堿熱處理、陽極氧化法、生物活性因子或仿生劑等內容，從微米水平的研究，逐步深入到納米、微納米級別。

本研究采用3組鈦片，其中酸蝕水熱處理組結合酸蝕處理和堿熱處理兩種方法。首先，使用HF和HNO3 兩種酸性溶液1∶1 混合雙重酸蝕的方法，形成微納結構，具有微觀的粗糙面，即可增加細胞與材料表面的接觸面積，又可提高細胞材料表面的穩定性。然后，對鈦片進行堿熱處理，浸入仿生體液（SBF）。Lenka Joná?ová 等[8]研究發現，經NaOH 處理的鈦片再浸入SBF 后，可在表面形成碳酸氫鹽-磷灰石層（HCA），但不均勻，而經酸蝕處理的純鈦片可形成均勻的微觀粗糙面，促進HCA形成，再經過堿化處理，磷灰石晶核形成均勻，沉積的HCA 厚度會隨著時間而增加[9]。結合兩種處理方法的鈦片表面，兼有微米級孔和納米級結構，具有更高的粗糙度，促進骨生成作用較強[10]。

等離子噴涂是一種材料表面強化、表面改性的技術，可使基體表面獲得耐磨、耐蝕、耐高溫氧化、電絕緣、隔熱、防輻射、減磨和密封等性能。當其應用于醫療領域時，可在人造骨骼表面噴涂一層10 μm 左右涂層，作為強化人造骨骼，加強親和力的方法。在口腔醫學領域，可作為涂層制備方法，用于種植體的表面改性[11]。目前，國內外對等離子噴涂羥基磷灰石（HA）進行較多的研究報道和臨床試驗，發現其具有無毒無害、耐腐蝕、耐磨耗、力學性能優良等特點，也存在包括涂層表面不均勻，涂層內含有雜質，涂層易出現裂隙，涂層密度不夠，界面被腐蝕后易脫落等問題[12]。

金屬鉭（Ta）具有機械性能良好、化學性能穩定等優點，已成為重要的現代功能性材料，被稱為“貴族金屬”。在現代醫學中，鉭金屬因耐腐蝕性和生物相容性的特點，引起了醫療和材料工作者的關注，在醫療領域廣泛應用，如外科手術材料、顱骨修補、血管縫合等。特別是鉭涂層，可提高金屬鈦的骨整合性能，增加細胞的粘附能力從而促進細胞生長，使金屬鈦獲得更高的表面能和更好的潤濕性，改善細胞與植入材料間的相互作用。

綜上所述，3組不同處理鈦片表面的ALP水平存在差異，鉭噴涂組高于酸蝕水熱組、光滑純鈦組，說明鈦鉭生物梯度材料有利于成骨，能提高ALP活性。這種新型鈦片處理方法存在哪些不足、需要如何改進、能否推廣使用，有待于今后進一步研究。