β-環糊精淫羊藿苷包合物對肝癌細胞體外增殖能力的影響

李燦燁，張嘉嘉，龐裕昌，劉靖

（佛山科學技術學院口腔醫學院，廣東佛山 528000）

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是一種黃酮苷類化合物，在藥理作用上不僅具有抗炎抗衰老、免疫調節、抗腫瘤等活性，在治療骨質疏松、精神類疾病如阿爾茲海默病、帕金森以及在風濕病、腦缺血和動脈粥樣硬化等多種疾病方面也具有很好的療效。

近年來，多項研究已證明淫羊藿苷對肝腫瘤有一定的抑制效果，且具有一定的劑量依賴性[1]。但是淫羊藿苷立體空間較大，在水中的溶解度低、溶出速度慢，生物利用度低[2]，其應用受到了極大的限制。近年來，研究人員致力于研究提高淫羊藿苷生物利用度的方法。

β-環糊精（β-CD）作為一種圓筒狀有機物，具有良好的水溶性，增溶效果好，不僅能夠有效地將淫羊藿苷進行包合并運輸[3]，而且對細胞無毒性[4]。本實驗將β-環糊精與淫羊藿苷以99∶1的質量比制備生成β-環糊精淫羊藿苷包合物，將其和淫羊藿苷分別作用于SMMC-S7721和Hep-G2肝癌細胞，比較研究β-環糊精淫羊藿苷包合物對SMMC-7721細胞和Hep-G2細胞體外增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株及培養

實驗所用SMMC-7721細胞株和Hep-G2細胞株為中山大學陶亮課題組所贈。細胞在含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養液中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱條件下培養。

1.1.2 試劑

青霉素-鏈霉素溶液，批號J190007，Gibco公司；RPMI-1640培養基，批號C11995500BT，Gibco公司；胎牛血清，批號1928700，BI公司；胰蛋白酶，批號2062475，Gibco公司；二甲基亞砜，廣州永津生物科技有限公司；CCK-8試劑盒，批號PH687，同仁化學研究所；淫羊藿苷，薩恩化學技術有限公司；β-環糊精淫羊藿苷包合物，佛山科學技術學院丁毅力課題組制作。

1.1.3 儀器

KosterCAM KMC-500倒置熒光顯微鏡，Carl Zeiss；Thermo 3111/8038二氧化碳細胞培養箱，Thermo Fisher Scientific公司；MK3&4MK2酶標儀，Bio Tek公司；超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；IC 1000自動細胞計數儀，上海睿鈺生物科技有限公司；TDZ5-WS高速離心機，艾本德中國有限公司；HWS-12恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

配置含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養液，將SMMC-7721細胞和Hep-G2細胞分別轉移至裝有5 mL培養液的培養瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養箱條件下培養，2 d更換一次培養液，并每天記錄細胞的生長狀況。

1.2.2 酶標儀法

檢測淫羊藿苷和β-環糊精淫羊藿苷包合物對肝癌細胞體外增殖的抑制作用：收集對數生長期生長狀況良好的SMMC-7721細胞和Hep-G2細胞，經胰酶消化處理后，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的培養液稀釋細胞懸液，配制成濃度為1×105cell/mL的兩種細胞懸液，分別接種在96孔板中，每孔接種100 μL細胞懸液。培養24 h后，β-環糊精淫羊藿苷包合物組每板分別加入100 μL不同濃度的β-環糊精淫羊藿苷包合物，使各組包合物終濃度分別為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，每個濃度5個復孔；淫羊藿苷組分別加入100 μL不同濃度淫羊藿苷，使其終濃度為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，每個濃度5個復孔，同一96孔板上設置空白組（培養基組）和對照組（純細胞組），放入培養箱中培養24 h后，每孔加入20 μL CCK-8，孵育3 h，波長為450 nm條件下測定各孔吸光度（OD）值，根據公式（1）計算細胞增殖抑制率。

1.3 統計學處理

采用SPSS Statistics 25統計軟件進行數據處理，結果以（±s）表示。不同濃度藥物組、空白組和對照組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 淫羊藿苷和β-環糊精淫羊藿苷包合物對SMMC-7721細胞增殖的影響

不同濃度的ICA和ICA包合物對Hep-G2細胞的增殖作用見表1。如表1所示，在藥物作用24 h時，對照組與不同濃度的淫羊藿苷藥物組、β-環糊精淫羊藿苷包合物組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.01），表明不同濃度的淫羊藿苷和β-環糊精淫羊藿苷包合物均對SMMC-7721細胞具有一定的抑制作用，呈劑量依賴性。同濃度β-環糊精淫羊藿苷包合物組淫羊藿苷含量是淫羊藿苷組的1%，但對SMMC-7721細胞的抑制作用明顯，表明β-環糊精淫羊藿苷包合物能夠有效提高淫羊藿苷抑制SMMC-7721增殖的能力。

表1 不同濃度的ICA和ICA包合物對SMMC-7721細胞的增殖作用

2.2 淫羊藿苷和β-環糊精淫羊藿苷包合物對Hep-G2細胞增殖的影響

不同濃度的ICA和ICA包合物對Hep-G2細胞的增殖作用見表2。如表2所示，在藥物作用24 h時，正常對照組與不同濃度的淫羊藿苷藥物組、β-環糊精淫羊藿苷包合物組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.01）；表明不同濃度的淫羊藿苷和β-環糊精淫羊藿苷包合物均對Hep-G2細胞均具有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。同濃度β-環糊精淫羊藿苷包合物組淫羊藿苷含量是淫羊藿苷組的1%，但對Hep-G2細胞的抑制作用高于淫羊藿苷組，表明β-環糊精淫羊藿苷包合物能夠明顯提高淫羊藿苷抑制Hep-G2增殖的能力。

表2 不同濃度的ICA和ICA包合物對Hep-G2細胞的增殖作用

肝癌全球發病率高，死亡率高[5]，是我國常見的一種惡性腫瘤[6]。淫羊藿苷是從淫羊藿屬植物莖葉中提取的黃酮類有效成分，作為一種具有極其廣泛的藥理作用的中藥單體，具有良好的開發前景。淫羊藿苷對腦缺血和缺氧癥狀有保護作用[7]，可用于治療帕金森病和阿爾茲海默癥等[8-9]，可幫助骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，改善骨質疏松[10]；治療乳腺疾病[11]，抑制腫瘤細胞的增殖。但由于淫羊藿苷水溶性不佳，生物利用度低，限制了其在臨床與基礎研究里的應用價值，因此提高淫羊藿苷的水溶性是當前研究的熱點。β-環糊精是一種優秀的藥物包合材料，結構中存在特定的疏水空腔，可以與膽固醇和磷脂等細胞內脂質通過主-客體相互作用，促進脂質的外流并且調節脂質穩態[12]。它能夠促進藥物吸收的同時還可以減輕藥物對機體的刺激，同時還作為緩釋和靶向制劑的載體[13]。同時β-環糊精不僅對藥物具有良好的增溶效果，它在提高生物利用度的同時還能減低藥物的毒性，而且其安全性已被廣泛認可[14]。

3 結語

本實驗顯示，不同劑量的淫羊藿苷和β-環糊精淫羊藿苷包合物對SMMC-7721細胞和Hep-G2細胞均具有一定的增殖抑制作用，特別是對Hep-G2細胞。含藥量較少的包合物組抑制效果明顯，表明β-環糊精淫羊藿苷包合物能夠提高淫羊藿苷藥物對這兩種肝癌細胞的抑制作用，具有較為廣闊的開發前景。