侵襲性真菌病非培養診斷技術的現狀及進展

楊玉琪，劉家云，徐修禮，周柯，周磊，孔美娟，張鵬亮

（空軍軍醫大學西京醫院檢驗科，陜西西安 710032）

真菌廣泛存在于自然環境中，一般在正常情況下不會對人體造成直接感染。但對于免疫缺陷或者長期接受免疫抑制治療的患者，真菌造成的感染卻是其常見的并發癥之一[1]。近年來，隨著皮質激素、免疫抑制劑、各種廣譜類抗生素的大量應用，以及器官移植、各種侵入性檢查和治療技術的開展，臨床深部真菌感染日益增多且趨向復雜化，常導致致死性感染，病死率極高，對患者健康造成極大威脅[2]。早期、快速診斷是侵襲性真菌感染患者得到有效治療、降低死亡率的關鍵因素。

目前，非培養技術既是一門傳統技術，也是一門新興技術，是國內外侵襲性真菌病診斷研究的熱點，其技術路線主要是基于免疫學原理的血清學方法和以PCR技術為基礎的分子生物學方法[3]。血清學診斷主要包括抗體檢測及抗原、代謝產物檢測兩大類。目前，部分血清學方法已經較為成熟，敏感性及特異性均較高，已應用于隱球菌病、曲霉病、念珠菌病以及組織胞漿菌病等侵襲性真菌感染的診斷，如1,3-β-D-葡聚糖試驗（1,3-β-D-glucan，G試驗）、半乳甘露聚糖試驗[4-5]（galactomanna，GM試驗）等。同時，分子生物學方法的飛速發展為臨床真菌的診斷開辟出了一條新的途徑。現就非培養技術的實驗室診斷研究現狀及進展予以綜述。

1 G試驗

1.1 G試驗的檢測原理和意義

G試驗是檢測真菌的細胞壁成分1,3-β-D葡聚糖，其可特異性激活鱟變形細胞裂解產物中的G因子，活化的G因子又可使凝固酶原轉化為凝固酶，通過旁路途徑激活鱟試驗，從而產生凝集反應[6]。該方法具有快速、操作方法簡單等特點，適用于隱球菌、接合菌以外的所有深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌引起的感染，可以及時有效地彌補常規診斷技術的缺陷[7]。

1.2 G試驗的檢測方法

用以測定G試驗的方法主要有凝膠法、濁度法和顯色法。凝膠法是通過使鱟試劑產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量測定真菌1,3-β-D葡聚糖或細菌內毒素的方法，通過觀察有無凝膠形成作為反應的終點。該法操作比較簡單、經濟，不需要專用測定設備，但只能進行定性或半定量測定，在臨床上的使用價值不高，故現已基本淘汰。濁度法又分為動態濁度法和終點濁度法，其通過檢測濁度增加的速度或反應混合物的濁度上升至預先設定的吸光度所需要的反應時間來測定真菌1,3-β-D葡聚糖或細菌內毒素的含量。顯色法又可分為動態顯色法和終點顯色法，是利用鱟試劑與1,3-β-D葡聚糖或內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色，根據釋放出的呈色團的數量來測定真菌1,3-β-D葡聚糖或細菌內毒素的含量。濁度法和顯色法因操作簡單、快速、靈敏度高、檢測范圍較寬，是目前國內外進行真菌1,3-β-D葡聚糖或細菌內毒素檢測常用的方法[8]。但是，因為所使用的試劑原料來源、對樣本處理和檢測方法的不同，使其臨床診斷價值也不完全相同，見表1。

表1 國外不同G試驗檢測方法對比

1.3 G試驗的影響因素

由于G試驗基于免疫學原理的固有屬性，影響其檢測結果的因素較多，從而導致檢測結果出現較高的假陽性和假陰性等問題。假陽性或假陰性情況的產生，主要來源于檢測方法的局限性。污染、靜脈制劑、肝硬化患者，使用抗腫瘤類藥物或者磺胺類、頭孢菌素類等藥物，甚至食用蘑菇類食物等，都會造成檢測結果出現假陽性的情況；而感染隱球菌或者接合菌，使用某些抗真菌藥物如卡泊芬凈，以及標本室溫下放置時間過長等，都會造成檢測結果出現假陰性的情況。為了確保檢測結果的準確性，應對實驗各個環節的質量加以控制。在采集標本時應做到無菌操作，并使用專用的無熱原真空采血管，采集后應及時送檢并及時檢測；對于常規患者應在早上用藥治療前空腹情況下進行采血；對于黃疸、溶血、乳糜標本，建議重新采血復查。進行樣本檢測前，需要首先制備合格的標準曲線，用以進行儀器的校準和室內質控；另外，在更換試劑批號時，應重新定制標準曲線。在樣本的處理檢測過程中，應避免操作過程中微生物的污染，同時確保使用器具無菌、無致熱原，并按照使用說明書進行標準操作。

2 GM試驗

2.1 GM試驗的檢測原理和意義

GM試驗是檢測曲霉菌細胞壁上的一種多聚糖抗原（即半乳甘露聚糖抗原），主要適用于侵襲性曲霉菌感染的早期診斷。據報道，有2/3的患者在其他診斷方法陽性之前6～14 d即可檢測到GM。另一方面，GM的釋放量與菌量成正比，可以反映感染的嚴重程度，連續檢測GM也可作為治療療效的監測[8]。

2.2 GM試驗的檢測方法及影響因素

目前，用以檢測GM試驗的檢測方法主要有ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶聯免疫吸附試驗）、RIA（Radioimmunoassay，放射免疫分析試驗）和乳膠凝集試驗，其敏感性和特異性也因試驗方法的不同而異。ELISA方法已在臨床上使用了二十多年，其敏感性高于乳膠凝集試驗，成為最常用的檢測GM的方法之一。當然，ELISA方法檢測半乳甘露聚糖也具有局限性。據報道，GM試驗的假陽性率為10%～15%，主要見于以乳制品為主食的嬰幼兒、異體骨髓移植患者、菌血癥患者、自身抗體陽性及接受白蛋白或者免疫球蛋白治療的患者，或見于使用半合成青霉素的患者等[9]。同時，GM試驗也具有一定的假陰性，主要見于使用抗真菌藥物、局部感染導致釋放入血的半乳甘露聚糖不持續以及非粒細胞缺乏患者等情況。

3 G試驗和GM試驗聯合檢測的臨床應用

雖然，G試驗和GM試驗均會受多種因素影響從而出現假陽性的結果，影響其診斷效力。但因G試驗和GM試驗具有不同的特點，引起其假陽性的因素也有所不同，具體如表2所示。將G試驗和GM試驗聯合檢測可最大程度地降低假陽性率[10]，從而可以更有效地診斷侵襲性曲霉菌的感染。

4 分子生物學方法應用于臨床真菌的診斷

隨著以G試驗和GM試驗為代表的血清學診斷方法越來越廣泛的使用，其暴露出的血清學診斷方法的不足也越來越明顯，臨床上假陽性和假陰性的報告也屢見不鮮[11-12]。近年來，分子生物學方法的飛速發展為臨床真菌的診斷開辟出了一條新的途徑。分子生物學方法的核心技術主要有核酸分子雜交技術和核酸擴增技術，其在真菌臨床檢驗的應用主要有兩大優勢：（1）分子生物學方法可以對真菌的菌種進行鑒定，尤其是形態學上難以區分確認的新種；（2）分子生物學方法可以直接檢測人體中真菌的感染情況[13]。利用真菌通用引物，通過PCR擴增技術，可以準確地鑒定不同種致病性真菌的種類，對于種類繁多、分類學上鑒定有局限性的菌株尤為適用。

5 結語

目前，雖然已有侵襲性真菌病診斷指南的出臺，但其臨床體征與表現存在不確定性，病情進展迅速且嚴重，難以預知，臨床醫師及實驗室人員診斷侵襲性真菌病面臨很大的挑戰和困難。雖然直接鏡檢、培養及病理學檢查仍是侵襲性真菌感染診斷的金標準，但早期、特異性地區分高危人群人體組織中處于定植及致病性的絲狀真菌也是侵襲性真菌感染診斷急需解決的問題。目前，基于免疫學原理的血清學方法和以PCR技術為基礎的分子生物學方法等非培養方法雖然有了較大發展，但同時其試驗也充滿各種不足，還具有很大的發展空間和挑戰。因此，立足并不斷改良現有侵襲性真菌病的傳統診斷學方法，結合血清學方法和分子生物學方法等早期、快速的診斷方法，合理使用高分辨CT等先進的影像學診斷技術，是目前早期、準確地診斷侵襲性真菌病的最佳途徑，可以滿足臨床治療的迫切需求。