地榆皂苷Ⅱ對人舌鱗癌細胞CAL27增殖能力的影響

吳澤承，張嘉嘉，彭紫嫣，林俊濤，楊安平，劉靖

（佛山科學技術學院口腔醫學院，廣東佛山 528000）

口腔癌在全國癌癥發病率排名第六[1]，是人體頭頸部的常見腫瘤之一。其中，舌鱗狀細胞癌的占有量高達90%，且預后較差，是患癌患者死亡的主要原因之一[2]。地榆屬薔薇科薔薇亞科植物在全世界有30余種左右，分布于歐洲、亞洲以及北美；我國有7種，南北各省均有分布[3]。地榆在我國始載于《神農本草經》，被列為中品。地榆屬植物中主要含三萜類、黃酮類、鞣質類、酚類以及無機微量元素和糖類等化學成分[4]，其中地榆皂苷Ⅰ含量在3.1%～7.7%，地榆皂苷Ⅱ含量在0.16%～0.87%[5]。地榆皂苷Ⅱ分子式為C35H56O8，結構式如圖1所示，是地榆中含有的一種三萜皂苷類化合物，有升高紅細胞、收縮血管、抗真菌等作用，臨床上用于治療炎癥、燙傷等疾病[6]。同時，王振龍等[7]研究發現地榆皂苷Ⅱ作用于癌細胞，能夠激活癌細胞中線粒體的凋亡通路，從而達到抑制細胞增殖的作用,地榆皂苷Ⅱ對于乳腺癌細胞株MDA-MB-231、乳腺癌細胞株MCF-7、卵巢癌細胞株SKOVE3、胰腺癌細胞株Capan-1以及肝癌細胞株HepG2等細胞系均有增殖抑制作用。目前，對地榆皂苷Ⅱ抗口腔癌的作用未見報道，本實驗采用臨床最常使用的抗腫瘤藥物紫杉醇作為陽性對照組，觀察地榆皂苷Ⅱ對人舌鱗癌細胞CAL27增殖能力的影響。

圖1 地榆皂苷Ⅱ結構式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人舌鱗癌細胞CAL27細胞系，武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養基，批號C11995500BT，Gibco公司；胎牛血清，批號1928700，BI公司；紫杉醇注射液，批號0031180202，上海創諾制藥有限公司；地榆皂苷Ⅱ，批號20181223，佛山市普達美生物醫藥科技有限公司；雙抗P/S，批號J190007，Gibco公司；CCK-8試劑盒，批號PH687，同仁化學研究所；胰酶，批號2062475，Gibco公司。

Thermo 3111/ 8038二氧化碳培養箱，Thermo Fisher Scientific公司；IC 1000細胞計數儀，上海睿鈺生物科技有限公司；MK3&4MK2酶標儀，Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將舌鱗癌細胞CAL27細胞系培養于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%的二氧化碳培養箱中培養。穩定后細胞呈貼壁生長，培養2 d后，用胰酶消化，用細胞計數儀顯示每毫升的細胞個數及細胞活性，待細胞數達到大于（5.0～7.0）×106個/mL、活性高于90%時，取細胞用于實驗。

1.2.2 溶液配制

配制濃度為6 mg/mL的紫杉醇原液，摩爾濃度為7 030 μmol/L，用培養基對其進行梯度稀釋，得到濃度為2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L的紫杉醇溶液。

配制濃度為100 mg/mL的地榆皂苷Ⅱ原液，摩爾濃度為165 000 μmol/L，用培養基對其進行梯度稀釋，得到濃度為33 μmol/L、66 μmol/L、99 μmol/L、132 μmol/L、165 μmol/L的地榆皂苷Ⅱ溶液。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖狀況

將CAL27細胞接種于兩塊96孔板，每孔接種6 000個細胞，分別加入不同濃度的紫杉醇、不同濃度的地榆皂苷Ⅱ。每個濃度設置5個復孔，同一96孔板上設置空白孔（培養基組）和對照孔（純細胞組）。培養24 h后，每孔加入20 μL CCK-8檢測液，培養箱37 ℃孵育4 h，然后用酶標儀檢測450 nm處各孔吸光度（OD）值。測完每板OD值后，將細胞板繼續放在二氧化碳培養箱培養，觀察藥物作用48 h的各孔OD值，根據公式（1）計算細胞增殖抑制率。采用SPSS0軟件包，采用分析-回歸-Probit分析計算兩種藥物IC50濃度。

1.3 統計學處理

用Prism 6.0繪制抑制率曲線，采用SPSS25.0軟件包對數據進行統計學分析，正態計量資料用（±s）表示，多個樣本均數間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.001為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度紫杉醇對CAL27細胞增殖的影響

使用CCK-8法檢測不同濃度紫杉醇對CAL27細胞作用24 h和48 h后的生長抑制率。圖2結果顯示，隨著紫杉醇藥物濃度的增大，藥物對細胞的增殖抑制作用呈現升高趨勢，與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.001）；藥物作用時間48 h的抑制作用與24 h相比有所降低，但也呈現一定的量效關系，與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.001）。24 h紫杉醇半數抑制濃度IC50是1.93 μmol/L，48 h紫杉醇半數抑制濃度IC50是7.66 μmol/L。

圖2 不同濃度紫杉醇對CAL27細胞作用24 h和48 h后的生長抑制率

2.2 不同濃度地榆皂苷Ⅱ對CAL27細胞增殖的影響

使用CCK-8法檢測不同濃度地榆皂苷Ⅱ對CAL27細胞作用24 h和48 h后的生長抑制率。圖3結果顯示，24 h后隨著藥物濃度增大，地榆皂苷Ⅱ對細胞增殖抑制作用呈現升高趨勢，與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.001）；藥物作用48 h后的抑制作用與24 h相比有所降低，但也呈現一定的量效關系，與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.05）。本實驗中，24 h紫杉醇半數抑制濃度IC50為1.93 μmol/L，48 h紫杉醇半數抑制濃度IC50是7.66 μmol/L；相同培養條件下，24 h地榆皂苷Ⅱ半數抑制濃度IC50為24.86 μmol/L，48 h半數抑制濃度IC50為33.58 μmol/L。紫杉醇和地榆皂苷對CAL27細胞的增殖都有抑制作用，且呈現量效關系。

圖3 不同濃度地榆皂苷Ⅱ對CAL27細胞作用24 h和48 h后的生長抑制率

比較圖2和圖3，可以發現相比紫杉醇陽性對照組，地榆皂苷Ⅱ模型組在作用24 h和48 h后的生長抑制率較為接近，說明地榆皂苷Ⅱ 48 h時的藥效下降幅度不大，藥效更持久。

本實驗采用紫杉醇作為陽性對照組，觀察了地榆皂苷Ⅱ對人舌鱗癌細胞CAL27增殖能力的影響。結果顯示，地榆皂苷Ⅱ作用細胞24 h后隨著藥物濃度增大，對細胞增殖抑制作用呈現升高趨勢，與對照組相比差異極顯著（P＜0.001），劉敏等[2]在研究姜黃素聯合紫杉醇對人口腔鱗癌細胞的增殖抑制及凋亡誘導作用中同樣也采用姜黃素梯度濃度作用于CAL27細胞，其24 h半數抑制濃度IC50為55 μmol/L，對比地榆皂苷Ⅱ半數抑制濃度IC50為24.86 μmol/L，地榆皂苷Ⅱ體現出更好的抑制增殖能力且用藥量少。同時，借鑒姜黃素聯合紫杉醇對人口腔鱗癌細胞的增殖抑制及凋亡誘導作用研究，也為本實驗的后續進展提供了一定的方向和思路，有助于后續實驗的開展。

3 結語

地榆皂苷Ⅱ對人舌鱗癌細胞CAL27增殖能力的抑制作用呈現量效關系，其與紫杉醇的48 h抑制率均低于24 h抑制率，且地榆皂苷各濃度下48 h抑制率比24 h抑制率降低的幅度相對較小，說明地榆皂苷Ⅱ抑制效果相對持久，其作用機制有待進一步研究。