CHO-K1細胞培養上清及其外泌體的蛋白質組分析

李浪，吳桐宇，姚宇峰，黃青麗，嚴繼舟*

（1.南昌大學 資源環境與化工學院，江西南昌 330031；2.上海賽唐生物技術有限公司，上海 201308）

目前，治療性重組單克隆抗體（mAb）和Fc融合蛋白在生物制藥市場上占據主導地位，其市場份額占所有生物治療制劑的35%[1]。mAB等復雜重組蛋白的生產需要能夠進行翻譯后修飾的宿主細胞表達系統，所以目前的治療性重組蛋白主要由哺乳動物細胞表達生產[2]。中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）能夠在化學成分明確的無血清培養基中穩定持續生長，具有良好懸浮培養適應力且能進行高密度、大量、分批補料培養，經過數十年的發展和技術優化，目前已經成為商業化生產治療性重組蛋白的首選工程細胞[3]。2006—2014年，歐盟和美國批準上市的112種生物藥物中，有65種是由CHO細胞表達生產的[4-5]。而2015—2018年，歐盟和美國共批準上市了68種治療性單克隆抗體藥物，其中57種是由CHO細胞表達生產的[6]。

CHO細胞能將表達的重組蛋白分泌到培養基中，并且超過15%的上清蛋白是目標產物[7]。工業化的CHO細胞能夠在無血清的培養基中懸浮生長，以排除血清中不確定的蛋白成分對重組蛋白的影響。但工業化生產重組蛋白的方式主要是分批補料培養，活細胞分泌或死亡細胞裂解釋放的蛋白質會隨著培養時間的增加而逐漸積累在培養基中，不可避免地會對重組蛋白的質量造成影響。

外泌體是由生物活細胞分泌的細胞外小囊泡，其中包裹著蛋白質、DNA和RNA，能夠介導細胞間的通信[8-9]。有研究發現，外泌體也能包裹重組蛋白[10]。因此，外泌體中的蛋白質組成與重組蛋白的質量也息息相關，而且外泌體的內含物的成分與細胞種類和狀態有關。

為了確定CHO-K1（倉鼠卵巢細胞亞株）細胞能夠分泌外泌體，同時鑒定無血清培養條件下CHO-K1細胞培養上清及外泌體中蛋白質的組成成分及性質，本研究采用膜親和結合分離技術從CHO-K1的培養上清中分離出外泌體，并用透射電鏡復染法對其進行形態學鑒定，同時運用液相色譜-質譜聯用技術對CHO-K1細胞的培養上清以及提取到的外泌體進行蛋白質質譜分析，并對鑒定到的蛋白質進行基因本體論（GO）注釋分析，為進一步研究CHO宿主細胞蛋白對重組蛋白的影響提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系來源

CHO-K1細胞系，購于賽百慷（上海）生物技術股份有限公司，初始為貼壁生長細胞，經無血清馴化后轉為懸浮生長細胞。無血清馴化后的細胞凍存于上海賽唐生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與試劑

FS-150N超聲儀，上海生析；1129 BBC 8生物安全柜，山東博科生物；QP-160 CO2培養箱，濟南鑫貝西生物；L530RL醫用離心機，湖南湘儀；CKX53緊湊型細胞培養顯微鏡，OLYMPUS；T75培養瓶，CORNING；3 kDa超濾離心管，Millipore；8～14 kDa透析袋，國藥；Q Exactive質譜儀，Thermo Fisher；Easy-nLC 1000液相色譜儀，Thermo Fisher；CHO細胞無血清培養基CHO Grow? CD、培養基DMEM/F-12和L-谷氨酰胺，上海源培生物；胰酶-EDTA消化液，Bio-channel；胎牛血清（Fetal bovinc serum），GIBCO；磷酸鹽緩沖液（PBS），海利克思；聚乙二醇 6000（PEG 6000），國藥；外泌體提取試劑盒（exoRNeasy Serum/Plasma Starter Kit），QIAGEN。

1.2 方法

1.2.1 CHO-K1細胞無血清培養馴化

為了確保收集到的上清蛋白均來自CHO-K1細胞，需要先將細胞馴化至無血清、無蛋白質成分的化學成分限定培養基中。用胰酶-EDTA消化復蘇后的貼壁細胞，以1∶2～5的比例分裝到75% DMEM/F-12（A）和25% CHO Grow? CD（B）的混合培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。觀察細胞生長狀態并及時傳代，待細胞完全適應當前混合比例的培養基后，將細胞傳至下一個混合比例的培養基中培養。重復上述操作，直到細胞完全適應無血清培養基。混合培養基的混合比例為75%A+25%B、50%A+50%B、25%A+75%B、5%A+95%B、100%B。待細胞完全適應無血清培養基后，每周按時傳代兩次。

1.2.2 上清蛋白質的提取

當CHO-K1細胞完全適應無血清培養基后，待細胞活力達到95%以上，細胞生長密度達70%～80%時，取20瓶細胞，將細胞懸液轉移至50 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，回收上清。將上清轉移到透析袋中，用PEG 6000于4 ℃包埋處理，并及時更換PEG 6000，當透析袋中的液體濃縮到合適體積后，將溶液轉移至3 kDa的超濾離心管中進行超濾濃縮，并用1×PBS進行緩沖液置換，最終將溶液濃縮至1 mL。因為蛋白質表達具有時空性，因此再取培養72 h后的細胞20瓶，按上述方法操作回收上清蛋白進行第二次質譜檢測。

1.2.3 外泌體的分離純化

實驗采用QIAGEN公司的exoRNeasy Serum/Plasma Starter Kit試劑盒收集CHO-K1培養上清中的外泌體。按“1.2.2”的方法濃縮細胞培養上清，用0.8 μm的過濾器過濾，將上清樣品和外泌體試劑盒中的XBP緩沖液在離心管中按1∶1比例混合，輕輕將離心管上下顛倒5次，混合均勻后加到exoEasy自旋柱上，500 g離心10 min。丟棄濾過液并將離心柱放回原來的收集管中。向離心柱中加入10 mL外泌體試劑盒中的XWP緩沖液，5 000 g離心5 min，棄去過濾液和收集管。將離心柱轉移至新的收集管中，向柱中加入400 μL外泌體試劑盒中的XE緩沖液，孵育1 min，500 g離心5 min，收集洗脫液。將洗脫液重新上樣至離心柱上，孵育1 min，500 g離心5 min，收集洗脫液并轉移至無菌離心管中，洗脫液中即為外泌體。

1.2.4 外泌體的鑒定

對收集到的外泌體采用透射電鏡負染法進行形態學鑒定。質譜鑒定外泌體蛋白成分，確定是否有外泌體的標志蛋白。

1.2.5 外泌體蛋白質的提取

收集得到的外泌體，用超聲儀破碎：80 W超聲2 s，停10 s，循環60次。12 000 g離心10 min。再取傳代72 h后的細胞20瓶按上述方法提取外泌體蛋白質重復進行第二次蛋白質檢測。

1.2.6 nano LC-ESI-MS-MS質譜檢測

樣本經酶解后用Easy nLC液相系統進行分離，緩沖液：A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱為5 μm C18柱（2 cm×100 μm），分析柱為 3 μm C18柱（75 μm×100 mm），流速300 nL/min，梯度洗脫。經色譜分離后的肽段用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。質譜分析時間為60 min，正離子模式運行，掃描范圍為300～1 800 m/z，質譜數據采集方法為每次全掃描（full scan）后采集20個碎片圖譜（MS2 scan）。二級質譜中動態排除設置為60.0 s。

1.2.7 數據分析

得到原始數據采用Mascot 2.2軟件進行數據庫檢索，蛋白質數據庫為中國倉鼠數據庫（Uniprot-CHO）。搜庫參數如下：enzyme為Trypsin；missed；cleavage sites設為2；固定修飾為Carbamidomethyl (C)；動態修飾設定Oxidation (M)。數據庫檢索鑒定到的蛋白質必須通過設定的過濾參數FDR≤0.01，score≥20。在得到搜庫結果后，滿足unique peptide≥1的為可信蛋白。對鑒定到的可信蛋白，通過Uniprot數據庫進行基因本體論（GO）注釋分析。

2 結果與分析

2.1 培養上清蛋白質質譜鑒定結果

兩次上清蛋白質的質譜檢測總離子流色譜圖見圖1。第一次質譜鑒定得到2 697個蛋白質，形成1 281個蛋白質組；第二次質譜鑒定得到2 497個蛋白質，形成1 202個蛋白質組。經過進一步篩選，最終從兩次培養上清樣本中鑒定出蛋白質1 243個。分子量和等電點的分布趨勢見圖2：培養上清蛋白質的分子量范圍在7.4（40S 核糖體蛋白S28，Q99PF7）～559.5（AHNAK蛋白，A0A3L7HVN8）kDa，主要分布在200 kDa以內。等電點分布在3.9（酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成員A，A0A3L7HQ41）～11.1（組蛋白H2A 1型，G3HDT6），集中分布在4～10。

圖2 上清蛋白質分子量及等電點分布

圖1 細胞培養上清蛋白質的質譜檢測總離子流圖

GO注釋結果如圖3所示，從細胞成分（CC）上看（圖3A），鑒定到的上清蛋白主要來源于細胞器和細胞的膜結構，分別占23%和12%。其中標志性的細胞器蛋白如內質網標志蛋白鈣網蛋白（Calreticulin，Q8K3H7）和蛋白質二硫鍵異構酶（Protein disulfideisomerase，A0A061I0G5），線粒體標志蛋白細胞色素C（Cytochrome c，G3H2K2）和己糖激酶-1（Hexokinase-1，G3H6T5），溶酶體標志蛋白溶酶體相關膜糖蛋白1和2（Lysosome-associated membrane glycoprotein-1/2，G3HK56/P49130），細胞膜標志蛋白如埃茲蛋白（Ezrin，A0A061IM94）等。除各種細胞內的蛋白外，還有8%的蛋白質屬于細胞外區域，這些蛋白由細胞內合成后轉運到細胞外，屬分泌蛋白。

圖3 上清蛋白質基因本體論注釋結果

從生物過程（BP）層面來看（圖3B），上清蛋白主要參與細胞過程（如細胞死亡、生長、識別聚集等過程）和代謝過程，分別占33%和21%。從分子功能來看（圖3C），上清蛋白主要是執行分子非共價結合功能和催化功能，分別占50%和33%。催化功能則是指具有催化活性的蛋白酶，通過進一步的GO注釋發現，具有水解酶活性的蛋白質最多（圖3D）。有研究顯示，這些水解酶是導致重組蛋白質量和活性下降的原因之一，如組織蛋白酶D（A0A3L7HWC9）被證明是重組單克隆抗體產生顆粒的原因[11]，基質金屬蛋白酶-19（A0A3L7IHE9）會切割重組蛋白[12-13]，羧肽酶（G3H1D5）則與重組組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）、重組人紅細胞生成素以及重組免疫球蛋白G（IgG）羧基端的賴氨酸和精氨酸異變有關[14]。

2.2 外泌體鑒定

形態學鑒定結果見圖4，電鏡下可見清晰的外泌體囊泡結構，直徑在100 nm左右，屬于外泌體的粒徑范圍（30～200 nm）。

圖4 外泌體形態學鑒定結果

質譜鑒定結果顯示，樣本中存在外泌體標志蛋白：膜連蛋白（Annexin，A0A3L7HVV8）、四次跨膜蛋白（Tetraspanin，G3HRL6）、腫瘤易感蛋白（TSG，A0A061I931）、Rab蛋白（Rab10/Rab11A，A0A3L7HB32/A0A3L7HV57）、熱休克蛋白90（HSP 90，G3HC84）和熱休克蛋白60（HSP 60，P18687）。結合形態學鑒定及標志蛋白鑒定結果，確認CHO-K1細胞能夠分泌外泌體。

2.3 外泌體蛋白質質譜鑒定結果

第一次外泌體樣本的質譜檢測總離子流色譜圖見圖5A，從中共鑒定出2 202個蛋白質，形成963個蛋白質組；第二次細胞外泌體樣本的質譜檢測總離子流色譜圖見圖5B，從中鑒定出3 047個蛋白質，形成1 550個蛋白質組。經過進一步的篩選，最終從兩次鑒定中確定了1 259個可信蛋白質。外泌體蛋白質分子量和等電點的分布趨勢見圖6，其分子量最小為5.6 kDa（40S核糖體蛋白S27，G3H513），最大為4 007 kDa（肌連蛋白，G3HAC6，因分子量過大未在圖5中展示），多數蛋白質的分子量集中分布在200 kDa以內。等電點則分布在3～12，4～10的蛋白質最多。

圖5 外泌體蛋白質的質譜檢測總離子流圖

圖6 外泌體蛋白質分子量及等電點分布

對外泌體蛋白的GO注釋結果見圖7，外泌體是脫離自細胞的雙層膜結構小囊泡，因此外泌體中的蛋白質主要來源于細胞器和細胞中的膜結構，分別占24%和13%（圖7A）。從生物功能方面來看（圖7B），外泌體中的蛋白質多數參與細胞生理過程和代謝過程，分別占34%和19%。從分子功能來看（圖7C），執行分子結合功能和催化活性的蛋白質最多，分別占50%和31%；執行催化活性的蛋白質中，同樣以水解酶的占比最多（圖7）。

圖7 外泌體蛋白質基因本體論注釋結果

3 結論

本實驗將CHO-K1細胞馴化至無血清的培養基中，完全排除了血清中蛋白質成分和外泌體成分對實驗結果的干擾。采用exoRNeasy Serum/Plasma Starter試劑盒從CHO-K1細胞的培養上清中提取外泌體，結合透射電鏡的形態學鑒定和標志蛋白的質譜鑒定確定CHO-K1細胞能夠分泌外泌體。

從培養上清樣本和外泌體樣本中分別鑒定到蛋白質1 243種和1 259種。基因本體論注釋結果顯示，上清蛋白及外泌體蛋白主要來自細胞器和細胞的膜結構；分子功能的注釋結果顯示參與分子結合和催化活性的蛋白質最多，執行催化功能的蛋白質中以具有水解酶活性的蛋白質最多，這些蛋白酶的積累很可能是重組蛋白質量和活性下降的原因之一。