親權(quán)鑒定基因座兩步突變分析

竇永恒，王潤(rùn)波，張靜，王海麗*

（1.河南省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院，河南鄭州 450002；2.河南事緣法醫(yī)物證司法鑒定所，河南鄭州 450002）

短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR）是人類的一類重要的遺傳標(biāo)記，在法醫(yī)學(xué)親子鑒定、個(gè)體識(shí)別及遺傳病連鎖分析等應(yīng)用中有重要作用[1-2]。在親子鑒定實(shí)踐中，出現(xiàn)STR基因座突變的現(xiàn)象是普遍存在的，且其發(fā)生突變的主要機(jī)制是復(fù)制滑動(dòng)突變，只涉及一個(gè)基序的加或減稱為一步突變，約占STR基因座的90%，少數(shù)突變基因會(huì)涉及幾個(gè)基序，稱多步突變[3]。多步突變是通過逐步突變形成的，突變的步數(shù)越多，其發(fā)生的概率越小，最多突變步數(shù)為四步。STR核心序列的變異可能導(dǎo)致對(duì)結(jié)果分析的偏差甚至誤判[4]。因此法醫(yī)物證工作者和遺傳學(xué)工作者對(duì)于STR基因座突變都很重視。現(xiàn)對(duì)1例出現(xiàn)兩步基因座突變的親子鑒定案件進(jìn)行分析，這在親子鑒定中出現(xiàn)的概率較小。

1 儀器與方法

1.1 儀器及試劑

AGCU EX22和AGCU EX 21+1熒光檢測(cè)試劑盒（包括ReactionMix、Primers、Taq酶、Allelic Ladder、AGCU MarkerSIZ-500等），購(gòu)自無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司；21Plex系統(tǒng)熒光標(biāo)記檢測(cè)試劑盒（包括2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA聚合酶、PCR Grade Water、Orange-500等），購(gòu)自江蘇蘇博醫(yī)學(xué)科技南京有限公司。Y-STR系統(tǒng)熒光標(biāo)記檢測(cè)試劑盒（包括5×PCR反應(yīng)緩沖液Ⅳ、5×27Y引物混合物、去離子水、ORG-500等），購(gòu)自基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司。GeneAmp 9700熱循環(huán)儀、3500xl型遺傳分析儀等均來自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。直徑1 cm大小血斑一份，常溫晾干后存儲(chǔ)于-20 ℃冰箱。

1.2 PCR擴(kuò)增和電泳分型

PCR擴(kuò)增采用血斑直接擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作。每次擴(kuò)增以陽(yáng)性對(duì)照DNA作陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照擴(kuò)增管中加入純水。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用ABI3500xl型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，由Data Collection v3.0數(shù)據(jù)收集軟件自動(dòng)收集電泳信息，電泳完成后把生成的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneMapper ID-X v1.5軟件中分析查看各基因座的基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)司法部《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T 37223—2018）和《法醫(yī)物證鑒定Y-STR檢驗(yàn)規(guī)范》（SF/Z JD0105007—2018），按照中國(guó)漢族人群STR基因座的等位基因頻率，根據(jù)規(guī)范推薦突變率，μ為平均突變率0.002，進(jìn)行親權(quán)指數(shù)（Paternityindex，PI）、累積親權(quán)指數(shù)（Cumulative Paternityindex, CPI）的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 常染色體STR基因座分型結(jié)果

親子鑒定案件運(yùn)用21Plex系統(tǒng)檢測(cè)21個(gè)基因座分型結(jié)果是否符合遺傳規(guī)律。在該例親子鑒定的案件中，發(fā)現(xiàn)存在兩步突變的可能，涉及的STR基因座為Penta E，其余20個(gè)基因座的檢測(cè)結(jié)果全部符合遺傳規(guī)律（圖1）。父親Penta E基因型為“14,22”，孩子Penta E基因型為“5,20”，孩子位點(diǎn)“20”與父親位點(diǎn)“22”相差兩個(gè)重復(fù)單位考慮有兩步突變的可能。進(jìn)一步采用AGCU EX22熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)22個(gè)基因座復(fù)核驗(yàn)證發(fā)生突變的STR位點(diǎn)，相同位點(diǎn)的基因座分型一致，除Penta E存在突變的可能，其余均符合遺傳規(guī)律（圖2）。

圖2 AGCU EX22親權(quán)鑒定試劑盒的Penta E位點(diǎn)分型圖

圖1 21Plex親權(quán)鑒定試劑盒的Penta E位點(diǎn)分型圖

2.2 新增基因座分型結(jié)果

采用AGCU EX21+1試劑盒進(jìn)一步檢測(cè)，包含21個(gè)STR基因座，其中D19S433基因座21Plex檢測(cè)系統(tǒng)中也包含，新增加的20個(gè)多態(tài)性STR基因座全部符合遺傳規(guī)律。

2.3 Y-STR基因座上的分型結(jié)果

本案例共又增加檢測(cè)了25個(gè)Y-STR基因座，被檢標(biāo)本C與被檢標(biāo)本F的Y-STR基因座完全一致，結(jié)果如表1所示。

表1 25個(gè)Y-STR基因座分型結(jié)果

2.4 突變基因座分析

依據(jù)人類染色體遺傳規(guī)律，孩子的遺傳基因一定來自親生父母雙方[5]。本案例的孩子突變基因座是由父親位點(diǎn)突變而來。Penta E基因座PI=0.002，（80×P20）=0.000 467 289 0，40個(gè)常染色體STR基因座分型后CPI值為247 186 029.723 9。案例突變基因座位點(diǎn)和PI計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 40個(gè)STR基因座分型結(jié)果及親權(quán)指數(shù)

所謂的突變均是建立于在認(rèn)定親權(quán)關(guān)系的假設(shè)上。STR基因座突變與遺傳多態(tài)性程度有著一定的關(guān)系，其主要機(jī)制為復(fù)制滑動(dòng)。復(fù)制滑動(dòng)突變主要表現(xiàn)為STR基因座等位基因重復(fù)單位的增加或減少[6]。序列結(jié)構(gòu)比較均一的基因座容易發(fā)生突變，而等位基因中含有不完全序列的基因座發(fā)生突變的概率較低，擴(kuò)增片段較大的STR基因座更容易發(fā)生突變，這可能是由于重復(fù)單位多的基因座其長(zhǎng)度也較長(zhǎng)，必然多態(tài)性程度也較高，其突變概率會(huì)隨之增加[7]。

司法鑒定技術(shù)規(guī)范要求累計(jì)親權(quán)指數(shù)大于10 000時(shí)，支持被檢測(cè)男子（或被檢測(cè)女子）是孩子生物學(xué)父親（或母親），累計(jì)親權(quán)指數(shù)小于0.000 1支持被檢測(cè)男子（或被檢測(cè)女子）不是孩子生物學(xué)父親（或母親）。如果只有1～2個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律，累計(jì)親權(quán)指數(shù)在0.000 1～10 000之間應(yīng)增加檢測(cè)其他高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的STR基因座，以避免由于STR基因座突變導(dǎo)致錯(cuò)誤地排除親權(quán)關(guān)系[8]。該二聯(lián)體案例首先用21Plex體系檢測(cè)20個(gè)常染色體STR，出現(xiàn)一個(gè)矛盾基因座Penta E，父親F為（14,22），孩子C為（5,20），相差2個(gè)重復(fù)單位，累計(jì)親權(quán)指數(shù)314.0986。用AGCU EX22體系驗(yàn)證其中20個(gè)常染色體STR基因座（包括突變基因座），分型結(jié)果均一致，累計(jì)親權(quán)指數(shù)685.439 4。考慮到是父子鑒定，使用Y-STR試劑盒進(jìn)一步擴(kuò)增檢測(cè)，被檢樣本F與樣本C的Y-STR基因型相同，說明二人符合同一父系遺傳規(guī)律。因?yàn)閅-STR基因座具有伴性遺傳的特征，不同基因座中存在連鎖的可能。本案例雖然檢測(cè)了25個(gè)Y-STR基因座，但是部分基因座之間存在連鎖不平衡，鑒于不同的群體中連鎖狀態(tài)不相同，群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)有限，檢測(cè)結(jié)果只是作為參考，未計(jì)算親權(quán)指數(shù)。

STR基因座等位基因的突變與性別也有著一定的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，來源于父親的突變多于來源于母親的突變。基因的突變率與細(xì)胞分裂次數(shù)密切相關(guān)[9]。由于男性精原細(xì)胞在發(fā)育成為精子前要經(jīng)過多次分離，且分裂次數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于女性卵原細(xì)胞分裂的次數(shù)，因而DNA復(fù)制發(fā)生滑動(dòng)錯(cuò)配的機(jī)會(huì)就增多，突變概率相應(yīng)增加。除此之外，年齡等因素的影響也會(huì)導(dǎo)致男性DNA突變率高于女性[10]。

3 結(jié)論

在親權(quán)鑒定過程中要注意STR基因座突變情況，檢測(cè)更多的遺傳標(biāo)記不僅能使累計(jì)父權(quán)指數(shù)達(dá)到認(rèn)定親權(quán)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)，也能發(fā)現(xiàn)更多的突變現(xiàn)象。通過多種PCR試劑盒的相互證實(shí)突變結(jié)果的客觀存在，并增加其他遺傳多態(tài)性好、突變率低的基因座位點(diǎn)進(jìn)行綜合判斷，排除各種可能因素的干擾，可以有效避免錯(cuò)判的風(fēng)險(xiǎn)，從而得到科學(xué)、客觀、可靠的鑒定意見。