降真香不同溶劑萃取物對口腔常見菌的抑菌活性研究

林俊濤，劉俊，徐紫丹，吳澤承，楊安平，陳鑫，劉靖

（佛山科學技術學院口腔醫學院，廣東佛山 528000）

齲病是口腔常見病，已被世界衛生組織列入人類三大重點防治疾病之一[1]。在政府“預防為主、防治結合、中西醫并重”的方針政策下，口腔疾病防治體系逐步健全。變異鏈球菌為常見的致齲菌，因其具有極強的產酸能力[2]，可以腐蝕牙釉質，破壞牙齒結構。因此，抑制變異鏈球菌生長繁殖對口腔齲齒的預防和治療將有重要意義。唾液鏈球菌在牙菌斑厭氧鏈球菌中占比大[3]，其菌量減少會導致口臭，過多也會破壞口腔內正常的生態系統[4]。

降真香，又名沙柑木、山油柑、沙塘木等，為蕓香科山油柑屬植物降真香，以根、果、葉入藥，為我國廣東、云南、廣西、海南等地區的地道藥材[5]。Lesueur等[6]研究發現，降真香揮發油具有廣譜抗菌活性。降真香所含的山油柑等化學成分對人體多種細菌均具有抑制作用，但未見其對變異鏈球菌（Streptococcus mutans，Sm）、唾液鏈球菌（Streptococcus saliva，Ssa）生長抑制作用的研究報道。本研究探究降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抑菌效果，為降真香在口腔領域的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

氯仿、乙酸乙酯，分析純，廣州試劑廠；氨芐西林（AMP），北京唯尚立德公司；BHI培養基，Oxoid公司；

MK3&4MK2酶標儀，Bio Tek公司；Thermo 3111/8038二氧化碳培養箱，Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.1 試驗材料

降真香乙醇提取物的氯仿萃取物（0.47 g/mL）、乙酸乙酯萃取物（0.40 g/mL），由佛山科學技術學院楊安平課題組提供，10% DMSO溶解；變異鏈球菌ATCC 25175和唾液鏈球菌ATCC 7073由佛山科學技術學院口腔醫學院微生物研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液的制備

取20 μL氯仿萃取物加入BHI培養基1 260 μL配成兩管體積為1 280 μL、濃度為7.34 mg/mL的藥液；取40 μL乙酸乙酯萃取物加入BHI培養基1 240 μL配成兩管體積為1 280 μL、濃度為12.5 mg/mL的藥液。取氨芐西林1 μL加入BHI培養基999 μL配成1 000 μL濃度為1 μg/mL的藥液作陽性對照。

1.2.2 菌液制備

將復蘇48 h后的變異鏈球菌菌種和唾液鏈球菌菌種接種到含BHI培養基的平板中，置于恒溫培養箱中培養過夜（37 ℃、5% CO2）培養16～18 h，用移液槍刮取適量菌種，配制0.5麥氏濁度（1×108）菌液1 mL梯度稀釋至106（1.5 mL），直接打入平板（做標記），取106管1.5 mL+BHI培養基13.5 mL各配置成15 mL終濃度為1×105菌液。

1.2.3 倍比稀釋法

將“1.2.1”中配備的氯仿萃取物藥液按2倍稀釋法溶于BHI液體培養基中，將菌懸液與含藥液的培養基按1∶1的體積比加入96孔板中；使各孔終質量濃度分別為3.670 mg/mL、1.835 mg/mL、0.918 mg/mL、0.459 mg/mL、0.229 mg/mL、0.115 mg/mL、0.057 mg/mL、0.029 mg/mL；將乙酸乙酯萃取物同上方法處理，使其各孔終質量濃度分別為6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.563 mg/mL、0.781 mg/mL、0.391 mg/mL、0.195 mg/mL、0.098 mg/mL、0.049 mg/mL；另選兩孔作陽性對照與陰性對照，陽性對照藥物為1 μL/mL氨芐西林。每個濃度設4個復孔，置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h、20 h，觀察結果。

1.2.4 抑菌率的測定

將藥液與菌懸液加入96孔板十字混勻后，置于酶標儀上測定0 h的初始OD600值，于12 h、20 h再次測定OD600值，按照公式（1）計算抑菌率。

1.2.5 統計學處理

各實驗數據用平均數±標準差表示。按照α=0.05的檢驗水準，相關數據采用SPSS 22.0統計學軟件進行統計學檢驗。P＜0.05，表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 降真香萃取物對口腔常見菌生長12 h的影響

如表1和表2所示，降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對變異鏈球菌生長12h的影響隨著氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物濃度增高，OD值逐漸減小，抑菌率上升，對變異鏈球菌的抑制作用越明顯。經秩和檢驗，各濃度組OD值總體均數不全相等，均具有統計學差異（P＜0.05）。

表2 乙酸乙酯萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長12 h的抑制作用

表1 氯仿萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長12 h的抑制作用

2.2 降真香萃取物對口腔常見菌生長20 h的影響

隨著降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物濃度增高，其對應OD值逐漸減少，抑菌率上升，對變異鏈球菌的抑制效果越明顯。經秩和檢驗，各濃度組OD值總體均數不全相等，均具有統計學差異（P＜0.05），結果見表3和表4。

表4 乙酸乙酯萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長20 h的抑制作用

表3 氯仿萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長20 h的抑制作用

其中當降真香乙醇提取物的氯仿萃取物的濃度為3.670 mg/mL時，其對唾液鏈球菌的生長完全抑制，12 h與20 h均無菌生長。

如表1～4所示，對于變異鏈球菌，在較低藥物濃度時，兩種萃取物OD均值相差不大；當藥物濃度較高時，氯仿萃取物的抑菌效果明顯優于乙酸乙酯萃取物。對于唾液鏈球菌，也可明顯看出氯仿萃取物的抑菌效果明顯優于乙酸乙酯萃取物。

藥物治療如早期采用青霉素等是齲病防治的方法之一，雖然有防齲效果，但是長期使用廣譜抗生素可能會引起口腔和腸道正常菌群失調。氟化物是目前研究最多的防齲藥之一，但氟本身卻具有毒副作用和氟釋放不穩定、持久性差等缺點。

近年來，通過對口腔致病菌耐藥性的深入研究，發現其耐藥性在不斷增強[7]。傳統中草藥中有不少具有清熱解毒、抑菌殺菌作用且毒副作用小的藥物[8]。使用中草藥防齲是目前的研究熱點，而其防齲的機制主要分為兩個方面：（1）抑制致齲菌的黏附，改變牙菌斑生物膜的結構；（2）對牙體組織起到再礦化作用[9]。隨著中草藥在抗菌領域的發展，單體江等人[10]研究發現降真香的提取物山油柑對大腸桿菌、樹青枯病菌等6種菌均有抑制作用，但對口腔常見致病菌的作用研究尚未見報道。本實驗通過研究降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抗菌效果，發現這兩種不同溶劑萃取降真香乙醇提取物均對兩種菌群有一定的抑制效果。降真香的提取物為紫黑色，初始濃度狀態下酶標儀無法準確測量其OD值，故本實驗將其進行稀釋處理。其中，氯仿萃取物的抑菌效果整體優于乙酸乙酯萃取物，氯仿萃取物在濃度為3.670 mg/mL時甚至有殺菌作用。

4 結論

降真香萃取物對變異鏈球菌和唾液鏈球菌的生長有很好的抑制作用，為降真香作為口腔疾病預防藥物或材料的開發提供了一定的依據，但其防齲機制仍需進一步探究。