抗幽門螺桿菌細胞空泡毒素納米抗體的制備及鑒定

劉曉芳，劉瓊，黃云祥，鐘引鳳，何慶華，李燕萍，涂追，付金衡*

（1.南昌大學 生命科學學院，江西南昌 330031；2.中德聯合研究院，江西南昌 330047；3.食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047；4.南昌大學基礎醫學院，江西南昌 330031）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種慢性感染的病原菌，世界衛生組織將其定為Ⅰ類致癌原[1]，細胞空泡毒素（Vacuolating cytotoxin，Vac A）是Hp產生并經自轉運蛋白途徑分泌到胞外的蛋白，在體外能使宿主細胞產生空泡變性，VacA還可引起線粒體膜通透性改變，抑制細胞凋亡[2]、誘導腫瘤細胞自噬[3]、促進HCO3-釋放并降低胃酸分泌[4]等。針對特異性識別VacA的研究主要體現在肽[5]、單鏈抗體（scFv）[6]、卵黃抗體[7]和單克隆抗體[8]，然而具有親和力高、穩定性好、免疫原性低、分子量小、易于基因工程改造的納米抗體[9-10]卻未見報道。

因此，本實驗聚焦抗Hp細胞空泡毒素納米抗體的研究，構建了納米抗體噬菌體免疫文庫，采用固相親和淘選技術，從該文庫中獲得了抗幽門螺桿菌VacA納米抗體，通過基因工程技術獲得了原核表達的納米抗體，并進行了初步功能鑒定，為抗幽門螺桿菌VacA納米抗體的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

幽門螺桿菌J99菌株質粒由南昌大學基礎醫學院劉瓊講師提供；大腸桿菌TG1、噬菌粒載體pComb3XSS、輔助噬菌體M13KO7、原核表達載體（pET25b）為實驗室保存；卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白（BSA），購自上海生工生物工程有限公司；TA克隆試劑盒購自Takara；EasyGeno快速重組克隆試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 獲取幽門螺桿菌VacA基因及原核表達

據NCBI上AF049653.1的VacA基因設計引物，VacA-F1為 5'-GGAATTCCGAAATACAACAA ACACACCGC-3'（EcoRI），VacA-R1 為 5'-CCG CTCGAGCGGATTGGTACCTGTAGAAACATTAC-3'（xhoI）。以Hp菌液為模板進行PCR擴增VacA基因。根據Mighty TA-cloning Kit進行TA克隆以減小序列突變的概率，電轉至E.coliDH5α感受態中，菌落PCR驗證陽性克隆并測序。EcoRI和HindⅢ雙酶切pMD20-T-VacA質粒和pET25b質粒，酶連電轉至E.coliRosetta感受態中，1 mmol/L IPTG 25 ℃誘導4 h，超聲破碎SDS-PAGE鑒定。

1.2.2 重組蛋白的變性、純化及復性

目的蛋白用包涵體洗滌液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton-100）洗滌，加入包涵體變性液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT，8 mol/L尿素），于4 ℃下變性1 h，離心取上清過Ni柱純化，在含高純度目的蛋白的洗脫液中加入等體積的復性液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L GSH，0.3 mmol/L GSSG，0.5 mol/L L-精氨酸）3次以逐步稀釋尿素濃度，用10 kDa透析管透析后備用。

1.2.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構建

用滅活的HpJ99菌株四次免疫羊駝后取血提總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，通過巢式PCR方法獲得VHH基因，第一步以AlpVh-LD（5'-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3'） 和 CH2-R（5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'） 為 引物，擴增出約700 bp的VH域；第二步以VHH-1（5'-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3'） 和 VHH-2（5'-CATGCC ATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCG CTGTGGTGCG-3'）或 VHH-3（5'-CATGCCATGACT CGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCT TGGG-3'）為引物，擴增出約500 bp的VHH基因。VHH基因和噬菌粒載體pComb3XSS用S fiⅠ單酶切，T4DNA連接酶連接后電轉至E.coliTGI感受態細胞中，固態培養12 h，M13KO7輔助噬菌體感染，構建抗Hp納米抗體的噬菌體展示文庫，并通過插入率、庫容及多樣性評估文庫質量。

1.2.4 抗Hp納米抗體噬菌體展示文庫的淘選及陽性噬菌體鑒定

以重組蛋白VacA為靶點，從納米抗體噬菌體展示免疫庫中篩選出能特異性結合VacA的納米抗體。按表1條件進行三輪篩選，每一輪篩選后，取10 μL洗脫物測滴度，剩余洗脫物擴增后用于下一輪的篩選。間接phage-ELISA鑒定陽性菌，具體操作方法參照文獻[11]。OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2視為陽性菌，將陽性菌進行特異性驗證并測序。

表1 固相淘選條件

1.2.5 抗重組幽門螺桿菌VacA納米抗體的原核表達

根據EasyGeno快速重組克隆試劑盒設計能特異性擴增VHH基因的引物F'（5'-AGCCGGCGATGGCCATGCAGTTGCAGCTCGTGGATGC-3'） 和R'（5'-ATCTCGAGTGCGGCCGCCTGGCCGGCCTGGCC GTCTTG-3'），pET25b（+）用 Nco Ⅰ和 Not Ⅰ雙酶切后，按EasyGeno快速重組克隆試劑盒配制10 μL的連接體系，于50 ℃反應15 min立即冷卻鈣轉至Rosetta（DE3）感受態細胞中固態過夜培養，隨機挑取單克隆進行菌落PCR驗證并測序。用0.1 mmol/L IPTG振蕩培養6 h超聲破碎，將含有目的蛋白的上清進行Ni柱純化，SDS-PAGE鑒定純化結果。

1.2.6 鑒定抗重組幽門螺桿菌VacA納米抗體結合Hp的活性

通過間接酶聯免疫吸附劑測定（ELISA），鑒定原核表達的抗VacA納米抗體結合Hp的活性[11]，包被3 μg/mL的幽門螺桿菌全菌蛋白，結合時，加入不同濃度的納米抗體，測OD450，根據OD450樣本值/OD450空白對照值≥2時，即認為納米抗體在該濃度下具有結合幽門螺桿菌的能力。

1.2.7 抗重組幽門螺桿菌VacA納米抗體抑制Hp鑒定

通過在一定時間內測定CO2濃度的變化，評估納米抗體抑制幽門螺桿菌活性的能力，即體外培養幽門螺桿菌至1×109CFU與不同濃度的納米抗體于4 ℃下孵育16 h，加入100 μL 500 mmol/L尿素和0.2 g/L的酚紅混合液于37 ℃下孵育3 h，每30 min測定OD550，根據公式（1）計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 幽門螺桿菌VacA基因的擴增、蛋白表達及純化

瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物如圖1A所示，大約2 200 bp左右有一條與幽門螺桿菌VacA基因理論分子量大小（2 248 bp）相近的條帶，故成功擴增到幽門螺桿菌VacA基因片段。陽性克隆子原核表達后SDS-PAGE電泳如圖1B所示，VacA重組蛋白分子量大小約85 kDa，與理論值相符，復性后獲得高純度的目的蛋白。

圖1 幽門螺桿菌VacA PCR產物及蛋白鑒定圖

2.2 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構建

如圖2A所示，在泳道1中可見18S和28S兩條帶，表明RNA沒有降解。兩步巢式PCR技術擴增VHH基因片段，第一步巢式PCR產物鑒定如圖2B所示，750 bp左右出現長鉸鏈重鏈抗體編碼的可變區基因目的條帶；第二步反應以第一步回收純化后的產物作為模板進行擴增，如圖2C所示，在450 bp左右出現與預期擴增的VHH片段大小相符的條帶，純化PCR產物將其與噬菌粒載體pComb3XSS分別進行S fiⅠ酶切，酶連后電轉至E.coliTGI感受態中，37 ℃固態培養12 h，隨機挑取24個單菌落進行菌落PCR驗證。如圖3A所示，在650 bp左右有條帶，計算出VHH基因插入率為87.5%，測序后進行多序列比對結果如圖3B所示，21個陽性克隆的基因均為編碼VHH的基因序列，抗體庫的有效庫容達到4.68×107CFU。

圖3 噬菌體展示文庫菌落PCR鑒定及序列比對圖

圖2 VHH總RNA及巢式PCR產物鑒定圖

2.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

以重組蛋白VacA為靶分子，經過3輪固相淘選，每輪以“吸附-洗滌-洗脫-擴增”為主要步驟，逐輪降低靶分子包被濃度、文庫投入量，通過增加洗滌次數來富集特異性結合VacA的納米抗體，結果如表2所示，噬菌體克隆得到有效富集。

表2 各輪淘選中結合VacA的噬菌體克隆的滴度和富集度

2.4 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

包被重組蛋白VacA，間接phage-ELISA鑒定陽性菌，將OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2的噬菌體送測序，采用Alignment進行多序列對比分析，得到6種抗體序列，選取吸光度值較高的陽性噬菌體進行交叉驗證，結果如圖4所示。克隆HV2-36 OD450值較高且與BSA和OVA無交叉反應，因此，采用HV2-36進行后續實驗。

圖4 間接phage-ELISA鑒定陽性菌

2.5 表達載體pET25b（+）-HV2-36的構建及納米抗體的表達與純化

陽性克隆的菌落PCR鑒定結果如圖5A所示，在750 bp處擴增到目的條帶及測序結果表明，表達載體pET25b（+）-HV2-36構建成功。將重組表達載體鈣轉至E.coliRosetta(DE3)感受態細胞，0.1 mmol/L IPTG誘導表達6 h，SDS-PAGE鑒定純化效果，結果如圖5B所示，在20 kDa處有符合目的蛋白分子量大小的條帶。

圖5 納米抗體重組載體克隆子的菌落PCR鑒定及原核表達圖

2.6 HV2-36結合幽門螺桿菌的活性分析

以破碎的幽門螺桿菌全菌蛋白為檢測抗原，分別測定不同濃度的納米抗體HV2-36結合幽門螺桿菌的活性。如圖6所示，納米抗體濃度為112.4 μg/mL時對Hp幾乎無結合力。

圖6 間接ELISA鑒定納米抗體結合幽門螺桿菌活性圖

2.7 納米抗體HV2-36抑制幽門螺桿菌活性分析

不同濃度的納米抗體與109CFU幽門螺桿菌J99菌株孵育，通過檢測一定時間內CO2濃度的變化，分析納米抗體抑制Hp活性的能力。如圖7所示，當納米抗體濃度在30 μg/mL時，HV2-36抑制率為31.13%。

幽門螺桿菌是一種引起多種疾病的革蘭氏陰性微需氧菌，其致病性主要與尿素酶B[12]、細胞毒素相關蛋白A、細胞空泡毒素[13]、黏附素[14]等致病因子有關。本實驗以重組蛋白VacA為靶標，從Hp滅活菌免疫后構建的噬菌體展示文庫中篩選出與重組蛋白VacA特異性結合的陽性噬菌體，測序發現，從多樣性較好的文庫中，淘選獲得了6種不同序列的陽性噬菌體。具有獨特性質的納米抗體，不僅能夠結合細菌表面抗原，拮抗細菌對宿主細胞的黏附[15]，還可通過拮抗細菌侵襲有關的毒力因子產生抗菌作用[16]。抗尿素酶B納米抗體能有效抑制尿素酶的活性，從而減少Hp在胃黏膜上皮細胞的定植，所以納米抗體被認為是一種頗具前景的Hp感染的治療方法[17-18]。

3 結論

本實驗挑選出與重組蛋白VacA結合力較高的HV2-36進行原核表達載體的構建，獲得了可溶性好且表達量高的HV2-36納米抗體，采用間接ELISA鑒定其能特異性結合Hp。HV2-36納米抗體濃度為30 μg/mL時，對Hp抑制率達到了31.13%，該研究結果為使用納米抗體檢測和治療幽門螺桿菌感染奠定了基礎。