響應面法優化無患子皂苷超聲提取工藝研究

陽春苗，王秋玲，梁芳，黃艷紅，覃日宏，楊小良

（廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，廣西南寧 530223）

無患子，又名油患子、洗手果，為無患子科無患子屬植物，以根與果入藥，主產于我國廣東、廣西、臺灣等長江流域以南地區[1]。無患子果皮為無患子假種皮，三萜類皂苷是其主要成分，具有抗炎抗菌、清熱化痰、鎮痛、降壓、降膽固醇等藥理作用，也有類肥皂的作用，是醫藥和日化行業的一種重要原料，具有良好的市場開發前景。

文獻報道的從無患子中提取皂苷的方法有多種[2]，其中超聲提取法時間短、操作方便簡單、提取效率高，在天然產物提取中應用廣泛。本研究采用Box-Behnken響應面法對無患子果皮皂苷的超聲輔助提取工藝進行優化，以期為無患子果皮的開發利用提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

野生無患子果皮，采集于廣西南寧市邕寧區，經鑒定為無患子科植物無患子Sapindus mukorossi Gaertn.的果皮。

1.2 儀器與試劑

高速多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；XS105DU電子分析天平，梅特勒-托利多公司；KQ-100DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S6數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療器械廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

齊墩果酸標準品，上海源葉生物科技有限公司；95%乙醇、冰乙酸、甲醇，分析純，西隴化工股份有限公司；香草醛，分析純，天津市光復精細化工研究所；高氯酸，分析純，上海朗源化工有限公司。

1.3 方法

無患子果皮中的三萜皂苷主要是齊墩果酸型[3]，本實驗以齊墩果酸標準品作為對照品，測定超聲提取法得到的無患子果皮總皂苷含量。

1.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取齊墩果酸標準品10 mg，以甲醇溶解后定容至100 mL，得齊墩果酸標準溶液濃度為0.1 mg/mL。取齊墩果酸標準溶液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL加入6支比色管中，每個濃度設3個平行樣品，置于70 ℃水浴中揮干甲醇，隨后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL為顯色劑，搖勻，于70 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，冰水浴中冷卻3 min，加入5 mL冰醋酸為溶劑，搖勻。以空白溶液作參比，用紫外可見分光光度計在400～600 nm掃描光譜，確定最大吸收波長后以此波長為條件測定吸光度[4]。以橫坐標為齊墩果酸對照品質量濃度，縱坐標為吸光度繪制標準曲線，求出回歸方程。

1.3.2 供試品溶液的制備

采摘當年成熟無患子果實，取果皮置于烘箱中60 ℃烘干、粉碎，過20目篩。準確稱取無患子果皮粉末1 g，置于25 mL錐形瓶中，按照設定的乙醇濃度、物料比和提取時間進行超聲提取，過濾得提取液，將提取液用甲醇定容稀釋100倍即得樣品溶液。精密量取0.2 mL樣品溶液置于比色管，用“1.3.1”處理齊墩果酸標準品的相同方法得到無患子果皮提取物待測溶液，于“1.3.1”下測得的最大吸收波長下測定吸光度，代入回歸方程，計算樣品中總皂苷的得率。

1.3.3 單因素實驗設計

對乙醇濃度、物料比、提取時間3個影響無患子果皮皂苷提取效果的參數進行單因素實驗，分別考察乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；物料比 1∶ 10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，（g∶mL）；提取時間10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 等不同條件對皂苷得率的影響[5]。

1.3.4 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，運用Design-Expert 8.0.6分析軟件，根據Box-Behnken設計原理，以無患子果皮皂苷得率為響應值，以乙醇濃度、物料比、提取時間為自變量，設計3因素3水平的響應面優化實驗，求出實驗模型，以確定超聲輔助提取無患子果皮皂苷的最優工藝[6]。實驗因素水平見表1。

表1 響應面設計因素及水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線

齊墩果酸標準溶液通過香草醛-高氯酸法顯色后在400～600 nm掃描光譜，在547 nm處有最大吸收，得回歸方程為Y=0.058 7X-0.037 4，R2=0.099 91，線性范圍 3～12 μg/mL。

2.2 單因素結果分析

2.2.1 乙醇濃度影響

按照“1.3.2”無患子果皮皂苷提取處理方法，物料比1∶10、提取時間30 min、乙醇濃度在30%～90%時測得無患子果皮皂苷得率與乙醇濃度的關系見圖1。

圖1表明，濃度為30%～60%時，皂苷得率隨乙醇濃度的增加而增加，乙醇濃度60%時，得率達到最大為15.33%；乙醇濃度大于60%后，皂苷得率逐漸下降，可能與乙醇濃度增大后溶劑極性降低，雜質溶出增多有關。因此，選擇最佳乙醇濃度為60%。

2.2.2 物料比影響

按照“1.3.2”無患子果皮皂苷提取處理方法，乙醇濃度60%，提取時間30 min，在50 ℃下物料比在1∶10～40時測得無患子果皮皂苷得率與物料比的關系見圖2。

圖2表明，物料比在1∶10～20，得率呈上升趨勢，在1∶20時得率達到最大為17.43%，說明此條件下的物料濃度差最有利于皂苷的溶出，隨后逐漸下降，可能是其他雜質溶出也增加后影響了皂苷的得率。因此，選擇最佳料液比為1∶20。

圖2 物料比對無患子皂苷得率的影響

2.2.3 提取時間影響

按照“1.3.2”無患子果皮皂苷提取處理方法，乙醇濃度60%、物料比1∶20、50 ℃條件下提取時間分別為10～60 min時，測得無患子果皮皂苷得率與提取時間的關系見圖3。

圖3表明，在10～30 min提取時間內，時間越長無患子果皮皂苷得率越高，30 min時得率最大為17.40%，繼續增加提取時間得率略有下降。說明超聲時間30 min使皂苷在物料和溶劑之間的傳遞已到達平衡，繼續增加時間不僅皂苷溶出量不會增多，反而會使分子結構遭到破壞。因此，選擇最佳提取時間為30 min。

圖3 提取時間對無患子皂苷得率的影響

2.3 響應面實驗結果與分析

2.3.1 回歸模型建立與分析

根據試驗設計方案，共設計了17個試驗點，由12個析因試驗和5個中心試驗組成，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面設計方案及結果

根據表2的實驗設計進行多元回歸擬合分析，以無患子果皮皂苷得率（Y）為指標，擬合后獲得了三因素的二次多項回歸模型為：Y=-6.053 25+0.230 73A+0.992 05B+0.407 55C+0.005 25AB+0.001 2AC-0.005 1BC-0.003 2425A2-0.027 97B2-0.006 467 5C2

為了檢驗無患子果皮皂苷提取工藝回歸方程的有效性，對軟件建立的模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸結果方差分析

表3顯示，該模型P=0.000 7＜0.001，說明回歸模型差異顯著。失擬項P=0.080 1＞0.05，模型失擬項沒有顯著性差異，擬合性良好可以用于分析實驗結果。決定系數R2=0.953 7，說明回歸模型與實際測量值具有較高相關性，超聲提取無患子果皮皂苷可以用此回歸方程進行結果預測。通過表中各因素P值可知，3個因素對超聲提取無患子皂苷得率的影響從大到小依次為B（料液比）、A（乙醇濃度）、C（提取時間）。顯著性影響因素包括A、B、AB、BC、A2、B2、C2，而C、AC為不顯著因素，一次項總體影響顯著（P＜0.05），二次項總體影響極其顯著（P＜0.001）。

為了直觀反應分析結果，利用Design－Expert8.0.6軟件繪制響應面分析圖與等高線圖，結果如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對響應值的效應面與等高線

2.3.2 無患子果皮皂苷超聲提取最優工藝驗證

根據模型回歸方程確定超聲輔助提取無患子果皮皂苷的最佳工藝條件為：乙醇濃度69.43%，物料比1∶21.56，提取時間29.44 min，在此條件下皂苷得率為16.19%。對最佳工藝進行3次重復平行驗證實驗，結果皂苷平均得率為16.17%（RSD=0.928%），與模型預測結果吻合較好。實驗結果表明，優化的皂苷提取工藝穩定可行，重復性良好，響應面法優化的參數具有一定的實用價值。

3 結論

本實驗在單因素實驗中，研究了不同因素對超聲輔助提取無患子果皮皂苷得率的影響，依據單因素實驗結果選取了對得率影響較大的乙醇濃度、物料比和提取時間3個因素進行響應面考察，且確定各因素的水平設置。實驗通過響應面優化超聲提取無患子果皮皂苷的提取工藝，結果顯示，乙醇濃度和物料比對得率的影響顯著，提取時間影響不顯著。經響應面優化得出超聲提取無患子果皮皂苷的最佳工藝條件為乙醇濃度69.43%、物料比1∶21.56、提取時間29.44 min，此條件下的得率為16.19%，通過驗證實驗，實際得率值為16.17%，RSD值為0.928%，此法適用于優化超聲提取無患子果皮皂苷，為無患子資源的進一步綜合開發利用提供了實驗依據。