類葉牡丹皂苷G在大鼠體內的組織分布研究

梁軍，宋艷，劉俊希，苑宏宇，黃曉瑩,夏永剛*，匡海學*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

類葉牡丹(CaulophyllumrobustumMaxim.)，別名紅毛七、威嚴仙、紅毛細辛等，為小檗科紅毛七屬多年生草本植物，根及根莖為主要藥用部位。類葉牡丹曾記錄于《中藥大辭典》，其性溫，味苦辛，歸肝、胃經，具有理氣止痛、祛風活血的功效[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明類葉牡丹具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和抗類風濕關節(jié)炎等作用[2-5]。廣泛生長于東北地區(qū)、西北地區(qū)、西南地區(qū)等的林下或者山溝陰處。在陜西地區(qū)，與桃兒七、鐵牛七、朱砂七等并稱為“太白七藥”，被記載于《本草綱目》，“凡杖撲傷損，瘀血淋漓者，隨即嚼爛，罨之即止，青腫者即消散”，所以也是治跌打、除風濕的民間常用藥[6]。

類葉牡丹皂苷G(Cauloside G)是類葉牡丹中主要的特征性成分，目前對于Cauloside G的組織分布研究鮮有報道，在課題組前期對類葉牡丹皂苷成分的化學及質譜分析的基礎上[7-11]，本實驗進行Cauloside G的組織分布研究，建立了一種UPLC-MS/MS法，測定Cauloside G在大鼠體內各主要臟器中的分布特點及組織藥物濃度隨時間變化的動態(tài)規(guī)律，為類葉牡丹中三萜皂苷類成分的進一步開發(fā)和利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

對照品Cauloside G，自制，經高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)檢測，純度>98%；內標偽薯蕷皂苷(IS)購自于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈和甲醇均為色譜級，購自于Thermo Fisher, Geel, Belgium；甲酸購自于Dikma,Lake Forest,USA；其他試劑均為分析級。水為純凈水，經Milli-Q純化過濾后使用。肝素鈉購自中國惠世生化試劑有限公司。

1.2 儀器

4000 QTRAP三重四級桿線性離子阱串聯(lián)質譜儀(美國AB Sciex公司)；組織勻漿機(上海凈信公司);Mettler-Toledo AB265-S天平(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.3 實驗動物

健康清潔級SD大鼠，雄性，體質量180～220g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證編號為SYXK(黑)2013-012。本實驗符合實驗動物倫理委員會的倫理學標準。

2 實驗方法和結果

2.1 色譜及質譜條件

類葉牡丹皂苷G液相色譜條件：色譜柱采用 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×150 mm,1.8 μm)、HSS T3預柱(2.1 mm×5 mm,1.8 μm)；流動相A：水(含0.1%甲酸)，流動相B：乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫，洗脫程序為0～4 min,30%～90% B;4～4.1 min,90%～30% B;4.1～5 min，30%～30% B。柱溫35 ℃ ,流速0.3 mL·min-1,進樣量5 μL。質譜條件：電噴霧離子源(ESI)；ESI-負離子模式，多重反應監(jiān)測(MRM)。

2.2 對照品溶液配制

母液配制:精密稱取Cauloside G為1.00 mg，用甲醇定容至1 mL EP管中，得到 1.00 mg/mL 母液，貯存于4 ℃冰箱中待用。

標準曲線工作液配制：分別精密移取上述標準品母液(1.00 mg/mL)，用甲醇稀釋得到100.0、10.0、1.0 μg/mL標準溶液。取大鼠心、肝、脾、腎、腦的空白組織勻漿液200 μL，分別精密加入Cauloside G和偽薯蕷皂苷內標，配制成相當于大鼠各組織藥物濃度的系列溶液：心(2.2、4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8和277.5 ng/mL)；肝(8.7、17.3、34.7、69.4、138.8、277.5、555.0和1 110.0 ng/mL)；脾(4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8、277.5和555.0 ng/mL)；腎(4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8277.5和555.0 ng/mL)；腦(2.2、4.3、8.7、17.3、34.7、69.4、138.8和277.5 ng/mL)，所有標準曲線工作液4 ℃條件下儲存。

質控樣品(QC)工作液配制：精密吸取Cauloside G標準品工作液(1.00 mg/mL)適量，同法配制低、中、高濃度混合質控(QC)樣品工作液，分別為心(2.2、22.3、277.5 ng/mL)，肝(11.1、111.1、1 110.0 ng/mL)，脾(5.56、55.5、555.0 ng/mL)，腎(5.56、55.5、555.0 ng/mL)，腦(2.2、22.3、277.5 ng/mL)，所有工作液4 ℃條件下儲存。

內標及工作液的配制：精密稱取偽薯蕷皂苷1.01 mg，用甲醇定容至1 mLEP管中，配置成濃度1.00 mg/mL母液。精密吸取偽薯蕷皂苷母液，用甲醇稀釋得到100.0、10.0、1.0 μg/mL工作液。再精密吸取內標工作液，配制成200 ng/mL內標工作液，貯存于4 ℃冰箱中備用。

2.3 動物實驗

將30只雄性SD大鼠按照5個時間點隨機分成5組，每組6只，除空白組給予等量的生理鹽水外，其余各組按照150 mg/kg劑量、單次灌胃給予Cauloside G，于給藥后0.5、1、2、4和6 h分別腹主靜脈采血后處死，立即解剖大鼠，摘取心、肝、脾、腎及腦等組織樣品，用生理鹽水沖洗至表面無血污后，濾紙吸干水分，-20 ℃保存待勻漿。

2.4 組織樣品的預處理

取-20 ℃保存的心、肝、脾、腎、腦組織樣品，室溫解凍后，精密稱重后，加入定量的生理鹽水(1 g組織加入5 mL生理鹽水)，用組織勻漿器充分勻漿。取200 μL血漿和空白血漿分別加入400 μL甲醇，渦旋1 min，再加入1 mL甲醇，渦流混旋1 min后，在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，40 ℃氮氣流下吹干，殘渣加甲醇100 μL復溶，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，5 μL注入LC-MS/MS系統(tǒng)進行分析。

2.5 方法學驗證

2.5.1 選擇性

取各組織空白生物樣品、加入標準品Cauloside G和IS的心、肝、脾、腎、腦組織樣品及大鼠給藥單體Cauloside G典型的色譜圖如圖1所示。結果表明，各組織中內源性物質對于單體Cauloside G的檢測沒有干擾。

注:A：空白生物樣品；B:加入標準品Cauloside G和IS的組織樣品；C：大鼠給藥Cauloside G的各組織樣品。圖1 各組織典型的色譜圖

2.5.2 標準曲線和最低定量限

如表1所示，是類葉牡丹皂苷Cauloside G在心、肝、脾、肺、腎、腦的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍最低定量限(LOQ)。在線性范圍內，其線性相關系數(shù)(R2)均大于0.99，表明Cauloside G相應濃度與其峰面積與內標峰面積比值具有良好的線性關系。LOQ是分析方法靈敏度的評價方法，LOQ滿足準確度為101.3%～105.30%，RSD<2.13 %，足以用于組織分布的分析。

表1 Cauloside G在不同組織中的標準曲線、線性范圍及最低定量限(n=6)

2.5.3 準確度和精密度

待測物的日內和日間精密度的RSD值均低于15%，準確度(RE)在-14.63 %～14.02%之間。結果表明，該方法的準確度和精密度良好。

2.5.4 提取回收率和基質效應

Cauloside G在各組織樣品中的提取回收率為87.45%～95.22%，RSD<7.90%；在三個不同的濃度基質效應為71.89%～82.32%，RSD<6.54%。以上結果表明，本方法能滿足各組織樣品的定量分析要求。

2.5.5 穩(wěn)定性

結果表明該分析物在4 ℃存儲12 h、-20 ℃儲存2周、-20 ℃儲存并反復凍融3次等條件下是穩(wěn)定的，準確度符合要求。

2.6 大鼠灌胃Cauloside G的組織分布研究

各組織按照“2.4組織樣品的預處理”項下操作，測定類葉牡丹中Cauloside G成分在大鼠各個臟器不同時間點的分布情況，結果見表2。結果表明，大鼠灌胃給予Cauloside G后，Cauloside G在大鼠的心、肝、脾、腎和腦中均有分布。心臟組織中，Cauloside G是在給藥0.5 h后濃度達到最高值，濃度為(53.7±7.60)ng/mL；肝、脾、腎、腦組織中，Cauloside G是給藥1 h后濃度達到峰值，濃度分別為(90.1±6.19)ng/mL，(103.2±17.67)ng/mL，(101.8±14.32)ng/mL，(68.2±14.76)ng/mL。

表2 Cauloside G在各組織中不同時間點的質量濃度(n=6,ng/mL)

3 小結

藥物在體內分布的速度決定了藥效發(fā)揮的快慢，分布迅速，藥效產生快，反之分布較慢，藥效產生慢[12]。本文研究表明Cauloside G灌胃給予大鼠后，心臟組織中，Cauloside G在是在給藥0.5 h后濃度達到最高值，給藥0.5 h后顯示濃度開始下降；肝臟組織中，給藥0.5～1 h內Cauloside G的濃度均呈現(xiàn)升高的狀態(tài)，給藥1h后顯示濃度開始下降；脾組織中Cauloside G是在給藥1 h后達到濃度峰值，濃度為(103.2±17.67)ng/mL，與其他組織相比，對脾組織表現(xiàn)出了更好的親和力；腎組織中，Cauloside G是在給藥后1 h迅速達到峰值；腦組織中，Cauloside G在給藥1 h后藥物濃度最高，隨后緩慢下降，在腦組織內表現(xiàn)出了緩慢代謝的特性。

總體來看，Cauloside G在肝、脾、腎這些血流量大的組織中的含量較高，對這些組織具有很好的親和力，而隨著時間延長藥物質量分數(shù)迅速下降，提示Cauloside G可能通過多途徑代謝；心臟組織中，Cauloside G表現(xiàn)出了分布迅速的特性；在腦組織中，Cauloside G成分也有分布，說明這個成分能夠透過血腦屏障。本文在一個選定的有效劑量單次給藥后，測定Cauloside G在大鼠體內不同組織中的分布特點及組織藥物濃度隨時間變化的動態(tài)規(guī)律，為類葉牡丹中三萜皂苷類成分的臨床應用和進一步解釋其作用機制提供實驗依據。