基于氣孔性狀的文冠果種質資源抗旱性評價及抗旱資源篩選

王孟珂 田夢妮 畢泉鑫 劉肖娟 于海燕 王利兵

（中國林業科學研究院林業研究所，國家林業局林業培育重點實驗室，北京 100091）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）無患子科（Sapindaceae）文冠果屬（Xanthoceras），灌木或小喬木，奇數羽狀復葉。主要分布在我國北部，西至新疆、寧夏，北至內蒙，南至河南［1］。文冠果是我國特有的木本油料作物，種子含油率較高，高達66.39%，脂肪酸組成良好，可作為理想的食用和工業用油樹種，國家林業局已將其列為生物質柴油原料基地建設的主要樹種［2～3］。然而，在我國文冠果主要分布的“三北”地區降雨量匱乏，干旱脅迫已是影響文冠果生長、品質以及產量的最為重要的因素之一［4］。

在非生物脅迫中，干旱脅迫對植物的危害較大，其中氣孔調節是抵御干旱脅迫和適應環境的機制之一［5］，植物體與外界進行氣體和水分交換都是通過氣孔來實現，氣孔的大小、密度和導度對干旱條件都有著適應性分化，因此氣孔特征在一定意義上可以作為抗旱性評價標準［6～7］。有研究表明，通過植物對干旱環境的不同響應，評價其抗旱性，在現有的種質資源中篩選出抗旱的優良種質，是一種可以實施的方法［8～9］。通常采用主成分分析、隸屬函數值和聚類分析等方法對氣孔性狀進行評價，從而評估植物的抗旱性［10～11］。

文冠果分布較廣，種質資源豐富，不同的種質資源的耐旱性差異明顯，但是目前我國對文冠果資源的抗旱評價較少，本研究是課題組在對我國文冠果資源全面調查分析的基礎上［4］，收集108 份文冠果種質資源，觀測氣孔的12項指標，綜合采用隸屬函數值法、聚類分析法和主成分分析法對文冠果種質資源進行抗旱性篩選與評價，篩選出抗旱的種質資源，可以為文冠果抗旱機制、相關基因挖掘等研究提供理想的材料，同時為抗旱育種、大規模栽培以及產業發展提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地內蒙古自治區鄂爾多斯市鄂托克前旗的文冠果良種繁育基地（107°29'，38°11），屬中溫帶溫暖型干旱、半干旱大陸性氣候。2017 年7 月，選取天氣晴朗的上午，對108 株長勢良好的8 年生實生文冠果的葉片進行采樣。于每株樹的正南方向選取無病害且長勢良好的成熟復葉片3～5 片，取中間小葉片20 片，放入FAA 固定液（70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL）中儲存。

1.2 試驗方法

用離析液使葉片解離。將FAA 固定液中的葉片取出，經50%、70%、85%、95%濃度的乙醇梯度分別脫水15 min，在每個葉片的左端、右端、底端和尖端各取0.5 cm×0.5 cm 大小的4 個正方形葉片置于試管中，并用蒸餾水沖洗，沸水浴7～8 min 后取出，待溫度冷卻至室溫后，用解離液（冰醋酸∶30%雙氧水=1∶1）將試管中的蒸餾水替換，換液后置于60℃烘箱7～9 h，待到葉片變為白色半透明狀后用蒸餾水沖洗，毛筆刷除葉肉部分，剩余葉片的下表皮用番紅—固綠染色［12］。

1.3 測定項目與方法

使用Motic DigiLabll 顯微數碼影像系統拍照觀察，Motic Iamges Plus 2.0 測量氣孔長度（SL），包括氣孔孔隙長軸長度（LAS）、氣孔孔隙短軸長度（SAS）、氣孔寬度（SW）、氣孔面積（SA）、氣孔周長（SC）、氣孔開口面積（ASO）、氣孔開口周長（CSO）、葉片面積（S）以及單位面積氣孔數量（Q），測量20個視野。根據上述指標計算氣孔密度（SD）、氣孔總面積占葉片面積比例（SP）、氣孔開口面積指數（SOI）和氣孔面積指數（SAI）。SOI 指理論上葉片氣孔的最大開口面積與葉片面積的比值。其中：

1.4 數據處理與分析

運用Microsoft Excel、Rstudio與SPSS 19.0軟件進行數據處理，根據108株文冠果的葉片的氣孔特征進行系統聚類、方差分析及主成分分析，采用Tamhane’s T2（M）法進行多重比較，運用隸屬函數分析法對文冠果抗旱性進行綜合評價［13］，隸屬函數值越大，抗旱性就越強；反之，抗旱性就越弱。計算隸屬函數值的公式如下：

式中：Ypq為第p組的第q個指標的抗旱隸屬函數值；λpq為第p組的第q個指標測定值；λqmax為第q個指標的最大值；λqmin為第q個指標的最小值；Yˉp為第p組植物的抗旱隸屬均值；n為所測指標數。

2 結果與分析

2.1 干旱環境對文冠果葉片氣孔的影響

對文冠果葉片氣孔各性狀進行統計分析表明氣孔特征、氣孔面積占葉面積比例和氣孔面積指數等性狀變幅不同（見表1），變異系數在10.12%～836.93%，說明供試材料的108 份文冠果種質資源存在明顯差異。其中氣孔開口面積指數在各材料之間存在較明顯的差異，變異系數為836.93%，氣孔長相比于其他性狀在各材料中的變異系數較低為10.12%。對葉片氣孔各性狀進行方差分析，108份文冠果種質資源各性狀均存在極顯著差異（P＜0.01），即文冠果不同種質資源葉片氣孔的各性狀對干旱環境均有不同程度的響應。

表1 108份文冠果葉片氣孔12個性狀變化統計Table 1 Statistics of 12 characters of stomata in 108 X.sorbifolium

2.2 氣孔的相關性分析

對108 份文冠果氣孔各性狀進行相關性分析（見表2），可以看出大多數性狀間存在顯著（P＜0.05）或極顯著相關（P＜0.01）。其中氣孔面積與氣孔長、氣孔空隙長軸長、氣孔寬、氣孔周長、氣孔開口周長、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數和氣孔開口面積指數存在極顯著相關。氣孔空隙短軸長和氣孔開口面積與氣孔密度成負相關（R=-0.496、R=-0.443）。說明在干旱環境中，葉片氣孔的各性狀間大多數存在相關性，但單個的抗旱性狀不能有效的評價文冠果種質資源的抗旱性，應對多種性狀全面的準確評價干旱下文冠果的特性。

表2 干旱地區108份文冠果種植資源葉片氣孔特征12個性狀之間的相關性分析Table 2 Analysis of the correlation between 12 traits of stomata in 108 X.sorbifolium in arid area

2.3 抗旱性狀的主成分分析

為篩選適合在干旱地區種植的文冠果種質資源，將氣孔的12項指標進行主成分分析，包括氣孔長度、氣孔空隙長軸長度、氣孔寬度、氣孔空隙短軸長度、單個氣孔周長、單個氣孔面積、單個氣孔開口面積、氣孔密度、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數和氣孔開口面積指數。分析結果見表3，其中特征值大于1 的主成分共3 個，累計貢獻率高達93.408%，說明這3 個主成分能夠反映文冠果氣孔特征的絕大部分信息。其中第Ⅰ主成分累計貢獻率為70.586%，為主要綜合因子，除氣孔空隙短軸長度與其相關性較弱外，其他變量均與其密切相關且為正相關，其中單個氣孔面積和氣孔密度的特征值較高。第Ⅱ主成分中氣孔開口面積指數特征值較高，第Ⅲ主成分中氣孔面積指數特征值較高。氣孔小且密度大有利于減少水分蒸發同時滿足自身所需的生理反應。

表3 文冠果氣孔結構指標主成分荷載矩陣Table 3 principal component load matrix of stomatal structure index of X.sorbifolium

2.4 抗旱性聚類分析及種質資源篩選

根據氣孔長度、氣孔空隙長軸長度、氣孔寬度、氣孔空隙短軸長度、氣孔周長、氣孔面積、氣孔開口面積、氣孔開口周長、氣孔密度、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數和氣孔開口面積指數對108份種質資源用離差平方和法進行聚類分析，結果見圖1。當歐式距離為5 時，108 份種質資源可分為三個類群，并對三個類群采用隸屬函數值進行抗旱性分析，第一個類群為抗旱節水型，綜合評價值為0.9，占供試材料的29%；第二個類群為中間型，抗旱性居中，綜合評價值0.46，占供試材料的45%；第三個類群為敏感性，抗旱性較差，綜合評價值0.22，占供試材料的26%。

干旱環境中3 組類型的葉片氣孔形態差異明顯（見圖2），抗旱性較強的A 組氣孔形態較小且密度較大，氣孔開度較小；抗旱性為中間型的B 組氣孔形態較大，氣孔密度和氣孔開度介于A 組和B組之間；抗旱性較差的C組氣孔開度較大。

將聚類分析得到的3 組氣孔的各項指標進行方差分析（見表4），氣孔長度、氣孔空隙長軸長度、氣孔寬度、氣孔空隙短軸長度、單個氣孔周長、單個氣孔面積、單個氣孔開口面積、氣孔密度、氣孔面積占葉面積比例、氣孔面積指數存在極顯著差異（P＜0.01），單個氣孔開口周長存在顯著差異（P＜0.05），其中氣孔長度、氣孔寬度、單個氣孔周長和單個氣孔面積在B 組最高分別為51.12 μm、39.65 μm、294.87 μm、1 605.43 μm2，在A 組中最低分別為47.08 μm、27.75 μm、251.57 μm、1 044.12 μm2；氣孔空隙長軸長度、氣孔空隙短軸長度、單個氣孔開口周長和單個氣孔開口面積在C 組最高分別為27.37 μm、6.57 μm、124.45 μm、144.87 μm2，A 組最低分別為23.24 μm、3.49 μm、101.07 μm、66.84 μm2；氣孔密度在A 組最高為475.39 個·μm-2，C 組最低為238.89 個·μm-2；氣孔面積占葉面積比例在B 組最高為60.79%，C 組最低為26.99%；氣孔面積指數在A組最高為1.05%，C組最低為0.58%。

表4 3種類型的文冠果氣孔的方差分析Table 4 Analysis of variance of three types of X.sorbifolium

對12個指標采用隸屬函數值法進行抗旱性分析，隸屬函數值越大抗旱性越強，從表5 中可知A組的綜合評價值最高為0.902，C 組的綜合評價值最低為0.221，因此在這些種質資源中抗旱性為A組＞B 組＞C 組。初步篩選出No.84、No.82、No.92、No.81、No.85、No.4、No.2、No.1、No.86、No.99、No.71、No.95、No.96、No.76、No.75、No.28、No.87、No.106、No.100、No.107、No.97、No.104、No.98、No.105、No.101、No.108、No.102、No.78、No.25、No.73和No.103，共31份種質資源適宜栽種在較為干旱的地區，為抗旱種質資源。

表5 文冠果氣孔結構指標的抗旱性評價Table 5 drought resistance evaluation of stomatal structure index of X.sorbifolium

3 討論

氣孔是高等植物與外界進行CO2和水氣傳輸的主要通道和調節器官，調節著植物的碳同化和水分散失的平衡關系［14］。氣孔調節是抵御干旱和適應環境的主要機制之一［15］，在干旱環境中，氣孔會較早關閉來減少葉片中水分的散失［16］。高光合效率的植物一般氣孔小而多，密度大，靈活性高，這些特征可使葉片減少水分散失，從而保持充足的水分供應來提高光合效率，植物的光合效率越高，表明植物的抗旱性越強［17］。氣孔面積指數決定氣孔導度的變化，一般氣孔導度隨水勢的下降而減小［18］，從達到減少水分散失的目的，氣孔面積占葉面積比例和氣孔面積指數均與葉片的氣孔導度呈顯著的線性正相關關系，較高的氣孔開口面積指數有利于植物保持體內與外部環境的水分平衡［19～23］，有研究表明輕度干旱會使細胞受抑制，葉面積減少［14］，氣孔密度增加，在重度干旱下葉片受影響嚴重，氣孔數目減少從而增加氣孔密度［24～26］。本研究表明，文冠果在適應干旱環境下會降低氣孔長度和寬度，從表1中可知抗旱性強的A 組類型的文冠果氣孔長度和氣孔寬度在三組中最小，但氣孔密度最高。干旱敏感型的C 組的氣孔面積指數、氣孔密度在三組中最低，C 組的種質資源在干旱地區的失水率可能較高，適應干旱能力較差。在干旱環境中A 組的調節能力要比C 組強。該結果與砂生槐（Sophora moorcroftiana）、赤皮青岡（Cyclobalanopsis gilva）幼苗、德國補血草（Linminoium tataricum）和番茄（Lycopersicon escul‐entum）等［27～30］相似。

近年來，對逆境下植物的生長機制的相關研究越來越多，如低溫脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫等，但最為常見的是干旱脅迫［31］，干旱作為植物生長過程中的主要制約因素之一，會阻礙植物的呼吸作用、光合作用和氣孔運動等，進而影響植物的生長發育和生理代謝［32］。植物對干旱脅迫下的響應，表現在多個性狀中，如主根的長短、葉片的厚度及氣孔的導度等，有研究學者表明單一性狀無法準確對植物的抗旱性做出準確評價［33］。采用主成分分析法確定各指標的權重，用隸屬函數法對篩選出來的指標進行抗旱性評價。

本研究的主要目的是評估文冠果葉片氣孔特征可否作為評價抗旱性的依據。結果表明本研究方法可以充分了解氣孔性狀在干旱環境下對文冠果生長的影響，明確文冠果不同種質資源之間的抗旱性差異。對來自干旱和半干旱地區的108 份文冠果種質資源材料進行研究，測定的葉片氣孔的12個性狀指標均發生了不同程度的變化。用主成分分析法進一步進行分析，得到了3 個主成分，特征向量載荷最大的是氣孔密度、氣孔開口面積指數和氣孔面積指數。通過主成分分析法和隸屬函數值法相結合的方法，將多個性狀簡單化，較詳細的反映文冠果種質資源的抗旱性信息，確定氣孔面積可作為抗旱鑒定的主要指標，同時篩選出31份抗旱文冠果種質資源材料。