小黑楊HD-Zip轉錄因子PsnHB63基因克隆及表達分析

韓連斌 國 慶 趙 凱 姜廷波 周博如 李 莉

（東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040）

轉錄因子（Transcription factor）也稱反式作用因子，是具有已知DNA 結合域結構特征的蛋白質分子［1］。同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白（HD-Zip）屬于同源異型盒（homeobox，HB）蛋白家族，包含高度保守的同源異型域（HD）和與其末端緊密相連的亮氨酸拉鏈域（LZ）［2～3］。HD 區是由3 個α 螺旋組成的三維空間結構；LZ 區一般是由5～6 個亮氨酸（Leu）殘基組成［4］。HD-Zip 轉錄因子存在同源或異源二聚體，能與DNA相結合，從而控制基因的表達。因此，同源異型域和亮氨酸拉鏈結構域的空間排列對于HD-Zip 轉錄因子特異性結合DNA序列起到了很關鍵的作用［5］。根據基因序列的保守性及結構特點，HD-Zip 家族可被分為4 個亞族，HD-Zip Ⅰ-Ⅳ6］：其中，HD-Zip Ⅰ亞族只包含HD 和LZ 結構域，主要參與植物對逆境脅迫的應答反應［7～8］、植物光信號轉導［9］、葉片和種子的發育調節［10～11］等過程；HD-Zip Ⅱ亞族另有N 端保守區域（N-term）和CPSCE 保守結構域［12］，在避蔭反應［13］、介導植物對光質改變時的應答［14］和響應非生物脅迫［15］等過程中發揮著重要作用；HD-Zip Ⅲ亞族比HD-Zip Ⅰ亞族多了START、SAD 和MEKHLA 結構域［16］，具有抑制轉錄的作用，主要參與植物分生組織的形成［17］、植物胚胎發育［18］和植物維管發育［19］等；HD-Zip Ⅳ亞族與HD-Zip Ⅲ亞族類似，但是沒有MEKHLA 結構域［20］，主要參與植物表皮細胞的發育［21］、植物物質積累及運輸［22］以及在植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫過程中起重要作用［23］。目前，許多植物都已經對HD-Zip 蛋白的的基因功能進行了分析和研究，如擬南芥［24］、玉米［25］、水稻［26］、黃瓜［27］、大豆［28］、龍眼［29］等。擬南芥HD-ZipⅠ亞族中參與非生物脅迫的基因有ATHB1、ATHB5、ATHB6、ATHB7和ATHB12［30］。有研究報道AtHB1只與TBP 相互作用，AtHB7與TBP 和TFIIB 相互作用，AtHB12只與TFIIB 相互作用，而AtHB13與TBP和TFIIB 沒有顯著的相互作用［31］。在HD-ZipⅡ亞族中其基因及啟動子識別的目標序列與其所含有的DNA 結合基序一致，導致該亞族內可能會形成復雜的調節網絡，其亞族中的任何一個成員都可以調節包括自己在內的所有蛋白的表達［32］。HDZipⅢ亞族的蛋白活性會被許多基因調控，例如，miR165/166 家族可結合到HD-ZipⅢ的START 區，限制其mRNA在細胞中轉錄后水平的積累，而在上游還有AGO10 和HYL1 基因可以誘導miR165/166家族的表達可以控制HD-ZipⅢ蛋白的活性［33］。

在擬南芥中報道的AtHB7基因是PsnHB63在擬南芥中的同源基因，已被證明參與了ABA 以及非生物脅迫的調節過程，在水分不足或ABA 處理下其表達會上調，同時還受鹽脅迫和滲透脅迫的誘導［34］。這證明HB63是一個關鍵的關于非生物脅迫的轉錄因子，也給我們研究楊樹的非生物脅迫提供了理論基礎。楊樹是目前研究林木遺傳轉化的木本模式植物。小黑楊（Populus simonii×P.nigra）是小葉楊和黑楊雜交而來［35］，小黑楊的材質細密，色白，心材不明顯，生長快，適應能力很強，是東北地區的推廣品種。但在小黑楊中并沒有研究過HB63基因。所以本研究為探明小黑楊PsnHB63基因應答高鹽及干旱兩種肋迫的表達特點，克隆PsnHB63基因，并進行生物信息學分析，用qRTPCR 分析PsnHB63基因在NaCl、干旱脅迫條件下的表達特性。為研究PsnHB63基因在楊樹抗逆中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 PsnHB63基因克隆

根據NCBI 基因庫毛果楊（Populus trichocarpa）HD-Zip 基因序列（Potri.002G176300.1）設計引物（見表1）。使用試劑盒提取一個月的小黑楊組培苗的總RNA，并反轉錄成cDNA 后進行PCR 克隆，送至哈爾濱擎科生物公司測序。

表1 HB63基因克隆及定量分析引物和載體引物Table 1 HB63 gene cloning and quantitative analysis primers and vector primers

1.2 PsnHB63 基因及蛋白質序列的生物信息學分析

使用ExPasy 的Protparam 在線分析PsnHB63氨基酸的理化性質；使用ProtScal 在線分析Psn-HB63 蛋白的親疏水性；使用Singa-P 對PsnHB63蛋白進行信號肽預測；使用TMPred 在線預測Psn-HB63 蛋白的跨膜結構；分別使用SOMPA 和Swissmode對蛋白的二級結構和三級結構進行在線預測和分析；運用NCBI 對PsnHB63基因序列進行同源序列比對，并利用MEGA 軟件（V5.2）構建系統進化樹；用Yloc 在線軟件預測PsnHB63的亞細胞定位情況。

1.3 植物表達載體pBI121-PsnHB63-GFP 的構建

根據載體pBI121-GFP 和PsnHB63基因序列全長，設計含XbaⅠ和SpeⅠ酶切位點的引物（見表1），PCR 克隆后雙酶切反應并膠回收，將純化后的pBI121-GFP 載體酶切產物與PsnHB63基因酶切產物用T4 DNA 連接酶連接，連接產物熱激法轉化到大腸桿菌TOP10 感受態中，將得到的陽性克隆菌落送至哈爾濱擎科生物公司測序。

1.4 基因槍瞬時轉化

構建PsnHB63基因的瞬時表達載體（pBI121-PsnHB63-GFP）。將提取的質粒包裹鎢粉，用基因槍（PDS-1000/He Particle Delivery System）轟擊洋蔥表皮，并在激光共聚焦顯微鏡（Olympus-FV1000MPE）下觀察亞細胞定位情況。

1.5 鹽和甘露醇脅迫處理下PsnHB63 基因表達分析

將長勢良好、長勢相似的1個月小黑楊組培苗土培1個月（相對濕度70%、每日14 h光照、平均溫度25℃），將材料分為45 組，每3 組進行同一處理。分別用水（對照組）、0.15 mol·L-1NaCl 脅迫處理和甘露醇模擬干旱處理0、3、6、12 和24 h 后，提取樣本根、莖、葉的RNA，將其反轉錄成cDNA，用BLAST 預測PsnHB63的保守結構域，并設計qRTPCR引物（見表1），熒光定量儀器型號為ABI7500，使用TaKaRa 熒光定量試劑盒，檢測目的基因的表達水平。以內參基因ACT 為對照，用2-ΔΔCT計算法計算其相對表達量。

2 結果與分析

2.1 小黑楊PsnHB63基因序列及理化性質

利用PCR 擴增克隆獲得全長717 bp 的Psn‐HB63基因序列（見圖1），與毛果楊基因庫序列相似性為99.02%。利用NCBI 對基因序列的分析可知PsnHB63基因的開放讀碼框717 bp，推測其編碼238 個氨基酸（見圖2）。使用ExPasy 在線Protparam 軟件預測出PsnHB63 蛋白的分子式為C1186H1860N332O387S10；原子總數為3 775；相對分子量為27 282.41；帶負電荷的殘基數（Asp+Glu）為42，帶正電荷的殘基數（Arg+Lys）為34；理論等電點（pI）為5.04；脂肪系數為59.87；消光系數為39 085；總平均親水性為-0.938，屬于親水性蛋白；不穩定系數為60.05，屬于不穩定蛋白。

2.2 小黑楊PsnHB63蛋白信號肽、跨膜結構域及親疏水性的預測與分析

通過在線軟件SignalP 預測PsnHB63 蛋白信號肽，結果表明該蛋白不存在信號肽（見圖3A）。預測結果說明PsnHB63 蛋白不是分泌蛋白或是一些細胞質基質中合成的運輸到細胞器中起作用的蛋白質，PsnHB63 蛋白合成后就于合成處發揮作用，不存在運輸。通過TMpred 軟件預測PsnHB63蛋白的跨膜結構域，結果表明該蛋白不存在跨膜結構（見圖3B），說明PsnHB63 蛋白不是定位于生物膜的膜蛋白。通過在線軟件ExPASy 的ProtScale 程序中的Kyteand Doolitlle 算法分析Psn-HB63 蛋白親疏水性，結果顯示分值為負的氨基酸多于分值為正的氨基酸，即親水大于疏水，因此推測PsnHB63蛋白是親水蛋白（見圖3C）。

2.3 PsnHB63 蛋白結構域及二、三級結構預測分析

使用NCBI 預測PsnHB63 蛋白保守結構域（見圖4）。經過分析得出該蛋白包括Homeobox 結構域和HALZ 結構域。Homeobox 結構域由第35 到84 的50 個 氨 基 酸 組 成，HALZ 結 構 域 由 第86 到127的42個氨基酸組成。

使用SOMPA 在線軟件對PsnHB63 蛋白的二級結構預測（見圖5A）。結果顯示該蛋白的二級結構由39.08%的α 螺旋（Alpha helix）、6.30%的延伸鏈（Extended strand）、1.68%的β 轉角（Beta turn）和52.94%的無規則卷曲（Random coil）組成。使用在線軟件ExPASy 的SWISS-MODLE 程序對Psn-HB63蛋白三級結構進行同源建模（見圖5B）。

2.4 PsnHB63基因的同源性分析

在線比對氨基酸序列，將小黑楊PsnHB63基因的氨基酸序列與相同基因的其他植物的氨基酸序列進行同源性比對，結果顯示，小黑楊與毛果楊（Populus trichocarpa）、銀白楊（Populus alba）、胡楊（Populus euphratica）、木薯（Manihot esculenta）等物種同源蛋白序列具有高度保守性（見圖6）。根據以上的比對結果，對這12 個物種的PsnHB63 蛋白構建系統發育樹（見圖7）。12 個物種中小黑楊PsnHB63與毛果楊、銀白楊、胡楊的HD-Zip蛋白遺傳距離較近，說明它們在進化的過程中親緣關系較為密切，與歐洲油橄欖、黃胡蘿卜的HD-Zip 蛋白遺傳距離最遠，說明它們進化的親緣關系也最遠，與其他物種的HD-Zip 蛋白進化的親緣關系較遠。

2.5 PsnHB63基因亞細胞定位實驗結果

觀察洋蔥表皮細胞中的GFP 熒光蛋白表達情況，結果表明，在轉入對照pBI121-GFP 空載質粒的洋蔥表皮細胞中均有熒光信號（見圖8A），而轉入pBI121-PsnHB63-GFP 表達載體的洋蔥表皮細胞僅在細胞核中發現綠色熒光信號（見圖8B），說HB63-GFP定位在細胞核，與預測分析結果一致。

2.6 鹽和甘露醇脅迫處理下小黑楊PsnHB63 基因表達分析

在0.15 mol·L-1NaCl 脅迫條件下，小黑楊莖和葉中的PsnHB63基因表達量呈現先升高后下降的趨勢，但總體是上調趨勢；小黑楊根中的PsnHB63基因表達量呈現先升高后下降的趨勢，但只在鹽脅迫12 h 之前是上調趨勢，在24 h 為下調趨勢。以脅迫0 h 的PsnHB63基因在小黑楊根莖葉中的表達量為對照組，根中在12 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的2.3 倍；莖中在3 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的5.7 倍；葉中在6 h表達量達到最高，約為對照組表達水平的8.2 倍（見圖9）。

在甘露醇模擬干旱處理下，小黑楊根和莖中的PsnHB63基因表達量呈現先升高后下降的趨勢，但總體是上調趨勢；小黑楊葉中的PsnHB63基因表達量先升高后基本持穩，但總體是上調趨勢。以脅迫0 h 的PsnHB63 基因在小黑楊根莖葉中的表達量為對照組，根中在12 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的4.7 倍；莖中在12 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的6.6 倍；葉中在6 h表達量達到最高，約為對照組表達水平的5.3 倍（見圖10）。

3 討論

植物經常會受到各種各樣的不適合生長、發育的生物、非生物脅迫（如干旱、高鹽和低溫）的影響。許多研究表明，HD-Zip 類轉錄因子參與了不同植物對各種非生物脅迫的反應。AtHB12基因在擬南芥中、HaHB4基因在向日葵中以及ZmHDZ4基因在玉米中的表達或過表達，HD-Zip 轉錄因子均增強了植物對干旱或鹽脅迫的耐受性［36-38］。苜蓿HD-ZipⅡ亞族的MTHB1基因在鹽脅迫下能提高植物的耐鹽能力［39］。以上研究都表明，HD-Zip基因在非生物脅迫反應中發揮著重要作用。

本研究從小黑楊中克隆出717 bp 的PsnHB63轉錄因子，該基因共編碼238 個氨基酸。通過對PsnHB63的氨基酸序列進行保守結構域的預測得知該蛋白包括Homeobox 結構域和HALZ 結構域；并通過預測得知該蛋白是不含信號肽和跨膜結構的親水蛋白。其二級結構是由39.08%的α螺旋、6.30%的延伸鏈、1.68%的β轉角和52.94%的無規則卷曲組成。亞細胞定位結果證明了PsnHB63基因定位在細胞核中。對生長狀態相同的小黑楊進行不同時間的鹽脅迫處理和甘露醇模擬干旱處理，通過RT-PCR 結果表明，在鹽脅迫處理下Psn‐HB63基因在莖和葉中的表達量顯著上調，在根的表達量12 h 前上調，在24 h 時下調；其中根在12 h表達量達到最高，約為對照組表達水平的2.3 倍；莖在3 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的5.7 倍；葉在6 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的8.2 倍；甘露醇模擬干旱處理下PsnHB63基因在根莖葉中的表達量均顯著上調；其中根在12 h表達量達到最高，約為對照組表達水平的4.7倍；莖在12 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的6.6 倍；葉在6 h 表達量達到最高，約為對照組表達水平的5.3 倍。以上結果表明PsnHB63基因可能參與了小黑楊的滲透脅迫過程，屬于逆境脅迫調控因子。