干旱脅迫對杜仲葉片結構特征的影響

何 鳳 杜紅巖 劉攀峰 王 璐 慶 軍 杜蘭英*

（1. 中國林業科學研究院經濟林研究開發中心，國家林業和草原局杜仲工程技術研究中心，鄭州 450003；2. 南京林業大學，南京 210037）

干旱是造成經濟損失的主要自然災害之一，對全球農作物生產的危害相當于其他自然災害之和［1］。植物可通過形態結構和生理生化功能的變化以適應干旱脅迫。葉片是植物進行光合作用和呼吸作用的主要器官，隨環境變化往往表現出其外部形態及內部解剖結構的差異，因此研究葉片的生態解剖學特征可以揭示干旱脅迫對植物的影響［2］。氣孔是與葉片的功能有著密切關系的生理器官結構，它既是與外界進行氣體交換的門戶，又是水汽蒸騰的通道，與抗旱性能密切相關，植物在干旱脅迫下可通過氣孔調節來適應［3～4］。

目前，已有諸多關于植物在干旱脅迫下葉片解剖結構和氣孔響應的研究。曹林青等［2］研究發現，油茶在中重度干旱程度下，成熟葉片出現葉片變薄，柵欄組織和柵海比變小，海綿組織厚度變化不顯著，氣孔面積、氣孔大小、氣孔開度減小，氣孔密度先減小后增大等解剖結構的變化，這些變化是油茶葉片對干旱逆境的適應特征進而維持生存和生長。黃絹等［5］研究發現，干旱脅迫下轉基因楊ABJ01 和非轉基因楊9#葉片厚度、上表皮厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度顯著降低，9#柵欄組織厚度顯著降低，而ABJ01 則顯著升高，表明ABJ01 具有更發達的柵欄組織，與很多植物相反，轉基因楊ABJ01 通過柵欄組織厚度的升高來適應環境的變化。董曉民等［6］研究發現，隨著干旱脅迫時間的延長，2 個扁桃品種葉片厚度均明顯減小，葉肉上下表皮細胞變小，細胞間隙變小，海綿組織厚度降低，柵海比值逐漸增大，這些葉片結構朝著耐旱的方向改變，以減少水分蒸發適應環境變化。龐杰等［7］研究發現，隨著土壤含水量下降，沙芥幼苗葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度呈下降趨勢，海綿組織厚度呈先下降后上升的趨勢，柵欄組織和柵欄組織/海綿組織呈先上升后下降的趨勢。高彥萍等［8］研究發現，經水分脅迫，大豆葉片氣孔密度增加，氣孔開口大小和單位葉面積氣孔相對面積減小，不同抗旱類型大豆氣孔密度變化幅度大小不同。劉世鵬等［9］研究發現，隨著干旱脅迫程度的增加，5 個品種棗樹葉片氣孔密度先升后降，長度和寬度之間呈極顯著線性關系，氣孔大小先減小后增大，密度與長度、寬度之間均表現為極顯著的負線性關系。Chartzoulakis K 等［10］研究發現，在干旱脅迫下橄欖葉片的柵欄組織、海綿組織的細胞間隙明顯降低，細胞密度明顯升高，這些變化導致單位葉面積增加進而促進CO2的吸收，從而在氣孔導度低的干旱條件下保持光合速率。劉球等［11］綜述了干旱脅迫對植物葉片解剖結構影響，為高等植物抗旱能力研究提供參考，文中介紹了不同植物葉片解剖對干旱脅迫響應不同。因此植物適應干旱環境的對策是多種多樣的，杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）屬杜仲科（Eucommiaceae）植物，該科僅有1 屬1 種，自古以取皮入藥而著稱，有關杜仲逆境脅迫的研究較少，且內容多集中在逆境生理指標［12～16］、光合特性等方面［17～19］，關于干旱脅迫下杜仲葉片結構變化的研究較缺乏［20］。本研究選取2 年生‘華仲6 號’杜仲扦插苗為試驗材料，干旱脅迫條件下觀察并分析其葉片外部形態特征，葉片下表皮氣孔特征、葉肉和葉脈顯微結構，探究杜仲幼苗葉片結構在不同程度的干旱脅迫下的變化及規律，進一步了解其干旱適應機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在國家林業和草原局泡桐研究開發中心原陽基地的大棚內進行。2018年12月將當年扦插生根的杜仲扦插苗‘華仲6號’幼苗移栽至高15 cm，入口直徑15 cm 的營養缽中，缽底有4 個小孔以保持下層土壤通氣性，每個營養缽中種植1 株，栽培土壤為基地內大田栽培土，土壤質地為壤土，全氮8.2 mg·L-1，全磷28.0 mg·L-1，全鉀5.0 mg·L-1，全鈣1 000.0 mg·L-1（全氮、全磷、全鉀、全鈣使用百靈達SKW500 儀器測定），每營養缽中土重約1.80 kg，田間持水量為40.11%，定植并澆透水放至大田中培養，保證土壤水分基本充足，確保苗木成活。

1.2 試驗處理

于2019 年5 月1 日選取長勢基本一致的營養缽苗（地徑4.45±0.57 cm，苗高19.09±4.96 cm）共72 盆移至簡易避雨棚中，防止雨水進入土壤水分控制區，每6 個營養缽苗放在1 個托盤里，托盤高5 cm，澆透水，托盤里盛一部分水，以保證每個營養缽的土壤含水量基本一致，之后每5 d澆透水1次。2019 年5 月16 日開始，對照（CK1、CK2、CK3）組每隔5 d 澆透水，干旱處理組采取自然干旱的方式進行，按停止澆水6 d（5 月22 日）、11 d（5 月27 日）、16 d（6月1日）作為水分干旱脅迫處理，3個時期分別編號為T1、T2、T3。各處理重復3次，每個重復4株，每次試驗采集對照組和干旱處理組葉片、根系附近土壤。每個重復采集頂部第1～5片成熟葉片混勻備用。從基地氣象站獲取試驗期間氣象數據。

圖1 為營養缽苗土壤質量含水量的變化和采樣期間試驗地氣溫變化。對照組幼苗土壤質量含水量為31.95%～34.29%，在干旱脅迫6 d、11 d、16 d 時，土壤質量含水量分別為24.54%、12.03%、2.60%。5月18日至22日和5月28日至6月1日的平均氣溫分別為22.32℃和22.37℃，這兩個時間段的氣溫相似，5月23日至27日的氣溫最高，平均氣溫為27.58℃。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤質量含水量的測定

采集扦插苗根部附近的土壤迅速放入鋁盒中，每個重復挖取1 個扦插苗附近的土，3 次重復，帶回實驗室，采用烘干法測定，取其平均值。

1.3.2 葉片相對含水量的測定

取樣后將葉片表面擦拭干凈，立即稱葉片的鮮質量（Wf），后將葉片浸入蒸餾水中24 h，取出用吸水紙吸干葉片表面水分，稱飽和質量（Wt），最后將葉片置于105℃烘箱中殺青15 min，于80℃下烘干至恒量，稱干質量（Wd），計算葉片相對含水量（RWC），每個處理3次重復，結果取平均值。

1.3.3 葉片細胞顯微結構觀測

每個重復選取1 片葉，3 次重復，取葉片中部連著中脈剪取1.5 cm×1.5 cm 的方塊，置于FAA 固定液（70%乙醇90 mL+甲醛5 mL+乙酸5 mL）中固定，于4℃冰箱中保存，用于做常規石蠟切片，材料經FAA 固定24 h 以上，乙醇和二甲苯系列脫水透明，浸蠟，包埋。切片（切片厚度8 μm）用番紅－固綠染色，中性樹膠封片后制成永久裝片，用顯微鏡觀察并照相，每個處理觀測6 個視野，用ImageJ 軟件觀察分析測定葉片柵欄組織、海綿組織、上表皮、下表皮、葉脈等結構參數，結果取平均值。

1.3.4 葉片下表皮氣孔結構掃描電鏡觀測

每個重復選取1 片葉，3 次重復，取葉片中部主脈一側剪取1 cm×1 cm 的方塊，置于電鏡固定液（2.5%的戊二醛）中固定，于4℃冰箱中保存備用做電鏡掃描，每個處理在掃描電子顯微鏡下觀察15個視野并拍照。從中選取1 張100 倍鏡的視野統計氣孔數目和閉合氣孔的數目，計算氣孔密度（個/mm2）和氣孔閉合百分比；從中選取2 張400 倍鏡視野用ImageJ 軟件測量每個氣孔的面積、長度、寬度，氣孔長度為平行于氣孔器的最長值，氣孔寬度為垂直于氣孔器的最寬值，求取2個視野下氣孔面積、長度、寬度的平均值。每個處理3次重復，結果取平均值。

1.4 統計分析

利用Microsoft Excel 2016 和SPSS 21.0 軟件對數據分析、顯著性檢驗和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 杜仲葉片解剖結構和下表皮氣孔特征

‘華仲6號’葉片形態結構為長橢圓形，葉緣鋸齒，葉尖尾尖，基部圓形，葉片嫩綠顯光澤，與一般雙子葉植物的葉相同（見圖2A）。葉片解剖結構可分為表皮、葉肉、葉脈，為背腹型葉。上下表皮均由1層表皮細胞組成，排列緊密。上表皮細胞較厚，由類橢圓形細胞排成1層；下表皮較上表皮薄，細胞體積較小，類長方形。葉肉有明顯的柵欄組織和海綿組織的分化，柵欄組織緊靠上表皮，排列緊密，細胞呈長圓柱形，內含類似小泡樣結構；海綿組織靠近下表皮，細胞較大，近橢圓形，靠近柵欄組織的葉肉細胞排列較為緊密，靠近下表皮的葉肉細胞排列較為松散無序，胞間隙較大，便于氣孔與葉肉之間的聯系（見圖2B）。

主脈由表皮、厚角組織、薄壁組織、韌皮部、形成層、木質部構成，為外韌型，略呈凹槽狀，木質部導管徑向排列緊密，韌皮部細胞較小呈密集無規則分布，形成層較明顯。韌皮部的外側有薄壁組織和厚角組織，共11～16 層細胞，厚角組織3～4層細胞，較為發達（見圖2C）。

氣孔器是指氣孔與兩個保衛細胞組成的復合體。植物體通過保衛細胞來調控氣孔的開張度，從而調節氣體的出入和水分蒸騰。從電鏡掃描照片看（見圖2D），下表皮向表面隆起，有大量氣孔器分布，氣孔器由兩個腎形的保衛細胞組成，呈橢圓形，無副衛細胞，兩個腎形細胞對稱排列，氣孔呈紡錘形。保衛細胞由幾個普通的表皮細胞不規則地圍繞，屬于無規則型。下表皮具角質層，呈棱狀突起往往沿著某一方向延伸。氣孔器的兩個保衛細胞表面光滑，在氣孔器周圍，常由4～5 條棱狀突起角質層環繞，個別的氣孔器外由光滑的突起包圍。氣孔與下表皮細胞處于相似的水平。

2.2 干旱脅迫下杜仲葉片相對含水量和表型特征變化

隨著干旱脅迫時間的延長，對照組的葉片相對含水量維持在74.88%～76.59%，干旱處理組葉片相對含水量持續下降；干旱脅迫6 d、11 d、16 d時，葉片相對含水量分別為75.63%、73.58%、56.11%（見圖3A）。處理組，干旱脅迫6 d 時，葉片相對含水量與對照無顯著差異，葉片長勢良好，無旱害癥狀（見圖3A，B）；干旱脅迫11 d 時，葉片相對含水量與對照無顯著差異，葉片出現微卷曲特征（見圖3A，C）；在干旱脅迫16 d 時，葉片相對含水量極顯著低于對照組，葉片明顯萎蔫卷曲下垂（見圖3A，D）。

2.3 干旱脅迫下杜仲葉片解剖結構特征變化

由圖4 可見，從葉片的橫切面可以看出，對照組葉片解剖結構細胞充盈，結構清晰，細胞間隙小，排列整齊（見圖4 CK1，CK2，CK3），葉片上、下表皮厚度分別為14.43～14.48 μm、12.64～12.72 μm，柵欄組織、海綿組織厚度分別為54.19～54.36 μm、85.20～85.88 μm（見表1）。由表1 可知，隨著干旱脅迫時間的延長，處理組柵欄組織的厚度與對照組相比變化不顯著；在干旱脅迫6 d、11 d 時，分別與對照CK1、CK2 相比，葉片的上、下表皮細胞厚度、海綿組織厚度均變化不顯著；在干旱脅迫16 d時，與對照CK3 相比，柵欄組織厚度、上表皮細胞厚度均變化不顯著，葉片海綿組織厚度、下表皮細胞厚度均顯著降低，分別降低了40.66%、27.04%，細胞之間相互擠壓變形；在干旱脅迫6 d、11 d 時，葉片的柵海比為0.64，與對照一致；在干旱脅迫16 d 時柵海比為1.07，顯著大于對照。由此說明，杜仲扦插幼苗葉片能忍受短期的干旱脅迫，葉片內部結構在短期的干旱脅迫下幾乎不受影響，超過一定長時間的干旱脅迫，葉片的內部結構會發生顯著變化。

表1 干旱脅迫下杜仲葉肉結構參數Table 1 Leaf mesophyll structure parameters of E.ulmoides under drought stress

2.4 干旱脅迫對杜仲葉片下表皮氣孔特征變化

圖5 是不同干旱脅迫時間下杜仲葉片下表皮氣孔器分布與氣孔特征。由表2可知，隨著干旱脅迫時間的延長，杜仲葉片氣孔密度呈現先升高后下降的變化趨勢；在干旱脅迫11 d 時，葉片氣孔密度最大，為308.03 個·mm-2，顯著大于對照；在干旱脅迫6 d 和16 d 的葉片氣孔密度，與對照相比均差異不顯著，分別為207.28、210.74 個·mm-2；葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度隨著干旱脅迫時間的延長變化趨勢一致，均呈先下降后升高的趨勢；在干旱脅迫11 d 時，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度為最小，與干旱脅迫6 d 相比，分別下降了59.22%，32.41%，28.40%，此時氣孔的閉合百分比最高，顯著高于對照。

表2 干旱脅迫下杜仲葉片下表皮氣孔特征值Table 2 Leaf stomatal structure eigenvalue of lower epidermis of E.ulmoides under drought stress

由表2 可知，在干旱脅迫6d 時，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均顯著大于對照CK1，氣孔密度差異不顯著；在干旱脅迫11 d 時，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均顯著低于CK2；在干旱脅迫16 d 時，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均與CK3無顯著差異。

由表2 可知，對照組之間相比，葉片氣孔密度相近，無大的變化；CK2 的葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均明顯大于CK1、CK3。

由表3可知，干旱脅迫6 d、11 d、16 d杜仲扦插幼苗葉片氣孔的長度、寬度、密度相關性及線性回歸方程，氣孔長度與寬度呈顯著正相關（R=0.896），氣孔長度、寬度與氣孔密度均呈顯著負相關（R=0.774，R=0.795）。

3 討論

作為直接接觸外界環境的器官，葉片是植物進化過程中對環境變化比較敏感、可塑性較強的器官，其外部形態和解剖結構特征的變化能較好地反映出植物對干旱等逆境的適應性［21～23］。葉片表皮上的氣孔，通過控制植物與外界的氣體和水分交換來適應復雜多變的環境，當土壤持續缺水、水分高度蒸發時，氣孔控制是植物限制水分丟失，防止植物受害的一種重要生理機制［24］。在研究干旱脅迫對植物生長的影響時，常用葉片氣孔密度和大小的變化來進行分析［9］。

發達的柵欄組織可避免植物葉肉細胞受強光灼傷的同時，充分利用衍射光進行光合作用，有利于植物保持水分以及更好地保護內部組織，從而提高植物的存活率并有助于植物生長［25］。葉肉柵欄組織發達、海綿組織厚度相對減少及葉片組織緊密度增大等特征，有助于CO2從孔下室傳導至光合作用場所，在氣孔導度較低的情況下維持植物較高的光合速率，提高植物的保水能力和抗旱能力［26］。隨著水分虧缺的嚴重，柵欄組織與海綿組織的比值會逐漸增大，葉片緊密程度不斷提高，表示植株抗旱能力在增強［27］。本研究中，‘華仲6號’杜仲扦插幼苗葉片的上表皮細胞厚度較下表皮細胞厚，海綿組織厚度厚于柵欄組織，柵欄組織表現出較強的干旱適應能力其厚度受干旱脅迫的影響不大。從干旱脅迫11～16 d，杜仲葉片的相對含水量顯著下降，葉片嚴重失水從而使海綿組織厚度顯著降低，細胞之間相互擠壓變形，柵欄組織與海綿組織的比值顯著增大且比值大于1，葉片緊密程度提高以此來提高杜仲葉片的抗旱能力。由楊秀平［28］等人研究得知杜仲葉片上表皮細胞無氣孔，具角質層，下表皮角質層薄，本研究中由于染色的原因，下表皮的角質層未看清楚。

本研究結果表明，隨著干旱脅迫時間的延長，土壤含水率的降低，杜仲扦插幼苗葉片氣孔密度表現為先增加后減少的趨勢，而氣孔面積、氣孔長度和氣孔寬度則表現為增加—減少—增加的趨勢，且氣孔長寬與氣孔密度均呈顯著的負線性相關，干旱脅迫下氣孔的長度和寬度減少和增大具有同步性。在干旱脅迫6 d 時，可能是因為適度的干旱脅迫有助于杜仲葉片氣孔的開張，對氣孔密度無影響；在干旱脅迫11 d 時，葉片氣孔密度顯著變大可能是由于水分脅迫影響了細胞的伸長，使葉面積變小，從而提高了單位葉面積上的氣孔個數，有研究表明氣孔密度越大，越有利于蒸騰作用快速地將熱量散掉，從而葉片可以避免因溫度過高使葉綠體及原生質變性［29］，氣孔大小減少能降低杜仲葉片水分蒸騰，使葉片具有保水作用；在干旱脅迫16 d 時，氣孔密度下降到對照水平，氣孔大小變大，可能是因為葉片受到嚴重水分脅迫，光合作用受到嚴重影響，減少了植株的能量供應，植株為了維持基本的生理過程，通過增大氣孔使光合作用速率不至于降到過低的程度［9］。氣溫也能影響氣孔的大小、密度［30］，本研究中，在干旱脅迫的第7～11 d，氣溫相對于其他兩個采樣時間均較高，可能是因為溫度適宜葉片的生長，對照CK2 的氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均明顯大于CK1 和CK3。

綜上所述，隨著干旱脅迫時間的延長，杜仲扦插幼苗葉片會出現嚴重的干枯卷曲，因此在栽培種植過程中扦插幼苗可以忍受短時間的干旱，在葉片出現萎蔫時要及時澆水。杜仲扦插幼苗厚度變薄的主要原因是海綿組織厚度變小，在干旱脅迫11 d 時，葉片氣孔產生小而密、氣孔閉合增多的生態適應特征，在干旱脅迫16 d 時氣孔呈現大而疏的適應特征。植物抗旱性是復合性狀，體現在生長形狀、生理特征、光合特性、解剖結構特征、分子基因表達等方面的變化［31］，本試驗重點關注‘華仲6 號’扦插幼苗的葉片結構對抗旱性的響應，存在一定局限性。干旱脅迫對‘華仲6 號’幼苗葉面積的影響，以及葉面積和氣孔密度之間的關聯，干旱脅迫下氣孔性狀對葉片光合作用、蒸騰作用等重要生理過程的調節功能，溫度、植物激素等與氣孔開閉的關系，其他生理生化方面和分子水平方面抗旱機制有待進一步研究。