越冬期紅葉石楠和桂花防御低溫強光傷害的光保護機制

胡文海 肖宜安 閆小紅 葉子飄 曾建軍 李曉紅

（1. 井岡山大學生命科學學院，吉安 343009；2. 江西省生物多樣性與生態工程重點實驗室，吉安 343009；3. 井岡山大學數理學院，吉安 343009）

低溫和強光是生長于亞熱帶及其以北地區常綠植物越冬期常遭遇的主要環境因子［1］。葉綠體能量代謝主要涉及原初反應、電子傳遞和光合磷酸化、碳同化等系列物理和生化反應，對光溫極為敏感［2～3］。冬季低溫抑制了常綠植物葉片光合酶活性，限制了碳同化的進行，這將導致葉片吸收光能超出碳同化所需，不僅造成葉片光抑制，而且還會誘發細胞內活性氧的產生和積累，并對光合機構產生破壞［4～5］。因此，冬季低溫強光環境下常綠植物存在因葉綠體能量代謝失衡而造成光抑制甚至光氧化傷害的潛在風險［6～8］。

常綠植物進化出了系列維持葉綠體能量平衡的越冬光保護策略，主要有以下3 方面：①通過葉片運動和降低葉綠素含量以減少光能的吸收；②上調熱耗散、圍繞PSⅠ的環式電子傳遞和光呼吸等能量耗散途徑以減少葉綠體內過剩能量積累；③增強細胞內活性氧清除能力以減少活性氧的積累與傷害［9～11］。例如，栽培于美國愛荷華州立大學的高山杜鵑（Rhododendron catawbiense）冬季葉片會通過下垂、卷曲和降低葉綠素含量以減少對光能的吸收，并上調葉片抗氧化酶活性以減輕活性氧積累與傷害［12］；生長于日本溫帶的常綠植物小葉 青 岡（Quercus myrsinaefolia）、紅 楠（Machilus thunbergii）和冷杉屬植物（Abies mariesii）在進入冬季后其葉綠素含量和PSⅡ反應中心功能明顯下調，而PSⅡ天線色素熱耗散能力則在進入冬季低溫前就被誘導增強［5，13］。我們的研究也表明，冬季廣玉蘭陽生葉可通過降低葉綠素含量和捕光色素分子數量以減少對光能的吸收，并且維持較強的光化學和熱耗散能力以保護光合機構免受低溫強光傷害；陰生葉雖然光化學反應能力相對較弱，但具有較強的熱耗散能力，從而有效地保護其免受短時暴露在強光下的傷害［14］。由此可見，不同植物種類和處于不同環境條件下的常綠植物具有不同的越冬策略［15］。

目前，關于常綠植物越冬光保護策略研究主要集中于溫帶及其以北寒冷地區，由于這些區域的冬季大多會出現長時間零下冰凍，其常綠植物在冬季基本處于休眠狀態，主要采取耐凍性或耐冷性越冬策略［6］。而亞熱帶地區四季分明且冬季以零上低溫為主，大多數常綠植物以休眠方式越冬，冬季的零上低溫伴隨著全光照并不會造成葉片不可逆光抑制傷害。但我們也觀察到，一些栽植于亞熱帶的常綠闊葉植物如紅葉石楠（Photinia ×fraseri）進入冬季前或冬季溫暖期仍可抽生新枝新葉，存在明顯的生長現象。那么亞熱帶地區冬季生長停滯的常綠闊葉植物和冬季仍有生長現象的常綠闊葉植物在防御冬季低溫強光的光保護機制上是否存在差異，其光保護策略又是如何適應其冬季的生長狀態？為此，我們采取冬季未見抽生新生枝葉的桂花（Osmanthus fragrans）和冬季有新枝葉抽生的紅葉石楠（P.×fraseri）為材料，利用葉綠素熒光技術對越冬期這兩種常綠闊葉植物陽生葉和陰生葉的PSⅡ功能與捕光色素分子內稟特性開展研究，以期探索亞熱帶地區常綠闊葉植物越冬光保護策略的選擇及其與生長狀態的內在適應性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗地點位于江西省吉安市井岡山大學校園內（115°1′18″E，27°6′41″N，海拔80 m）。吉安市屬于典型的中亞熱帶濕潤季風區，年平均最低氣溫為5.2～6.9℃，極端低溫為-7.2～10℃［16］。實驗于2017年1月進行，試驗期間為連續晴天，日最高和最低氣溫（晝夜）為14℃/4℃。選擇校園內生長于全光照環境下、植株高約2.5 m的紅葉石楠和桂花作為材料，于上午9：00選擇陽生葉和陰生葉各5片，帶枝剪下插入水中帶回實驗室進行葉綠素熒光的測定，12：00時陽生葉葉表光照強度約1 500 μmol·m-2·s-1，陰生葉葉表光照強度約120 μmol·m-2·s-1。

1.2 測定項目和方法

1.2.1 葉綠素熒光參數測定方法

葉綠素熒光參數采用Dual-PAM-100/F（Heinz Walz GmbH，Effeltrich，Germany）進行測定。先進行葉綠素熒光快速光曲線的測定，將葉片暗適應30 min 后，分別測定其最小熒光（Fo）和最大熒光（Fm），然后依次開啟11～918 μmol·m-2·s-1的光化光，每個強度的光化光照射葉片10 s后，依據Dual-PAM-100 使用說明書進行葉綠素熒光快速光曲線的測定。然后再進行葉綠素熒光誘導曲線的測定，將葉片再次進行暗適應30 min，測定Fo和Fm后，開 啟416 μmol·m-2·s-1的 光 化 光，依 據Dual-PAM-100 使用說明書進行葉綠素熒光誘導曲線的測定，每20 s 記錄一次測量參數。光化光由儀器內置的LED 光源提供635 nm 光線，由儀器測定軟件直接給出PSⅡ光化學反應所利用的能量（Y（Ⅱ））、PSⅡ調節性能量耗散（Y（NPQ））和非調節性的能量耗散（Y（NO））以及光化學猝滅系數（qP）、非光化學猝滅系數（NPQ）等葉綠素熒光參數，并計算。

PSⅡ最大光化學效率：

PSⅡ潛在光化學效率：

PSⅡ光合電子傳遞速率：

1.2.2 葉綠素含量的測定

將進行了葉綠素熒光測定的葉片打孔取樣，按Arnon［17］的方法，采用丙酮法進行葉綠素含量的測定。

1.2.3 光合生理參數的計算

依據Ye等［18～19］光合電子流對光響應的機理模型，利用模型建立者葉子飄博士提供的光合計算軟件（光合計算4.1.1 版本），擬合ETR快速光曲線，計算最大光合電子流（Jmax）和飽和光強（PAR‐sat）。并按Ye等［18～19］的方法計算捕光色素分子總數（N0）、處于激發態的捕光色素分子數（NK）、本征光能吸收截面（σik）、有效光能吸收截面（σ′ik）、處于激發態的捕光色素分子最小平均壽命（τmin）。

1.2.4 實驗數據統計

利用SPSS11.5 數據分析軟件進行實驗數據統計檢驗。采用t檢驗分析不同物種內不同處理間的差異性，當P＜0.05 時認為差異顯著。采用OriginPro 8.5軟件完成作圖。

2 結果與分析

2.1 光化學效率、qP和NPQ的比較

越冬期紅葉石楠陽生葉和陰生葉的Fv/Fm和Fv/Fo顯著高于桂花，且兩種常綠植物陰生葉的Fv/Fm和Fv/Fo均高于陽生葉（見圖1：A～B）。光化學猝滅系數（qP）隨光強的增強而下降，紅葉石楠陽生葉和陰生葉的qP沒有差異，桂花陰生葉qP則顯著低于陽生葉（見圖2A）。固定光強下，qP隨著光照時間的延長而上升，且兩種常綠植物陰生葉qP均低于陽生葉（見圖2C）。無論是快速光曲線還是誘導曲線，桂花葉片的qP均明顯低于紅葉石楠（見圖2：A，C）。非光化學猝滅系數（NPQ）則隨光強的增強和光照時間的延長而上升，其中紅葉石楠陰生葉NPQ顯著高于陽生葉，而桂花陰生葉NPQ則低于陽生葉；快速光曲線中桂花陽生葉NPQ顯著高于紅葉石楠，而光誘導曲線中兩種常綠植物陽生葉的NPQ沒有顯著差異（見圖2：B，D）。

2.2 吸收光能分配的比較

在各測量光強下，紅葉石楠陽生葉和陰生葉的Y（Ⅱ）均明顯高于桂花，但紅葉石楠陽生葉和陰生葉間Y（Ⅱ）無明顯差異，而在較高光強下桂花陽生葉Y（Ⅱ）高于陰生葉（見圖3A）。PSII 調節性能量耗散（Y（NPQ））隨著光強的增加而上升，紅葉石楠陰生葉Y（NPQ）顯著高于陽生葉，而桂花則表現為高光強下陰生葉Y（NPQ）稍低于陽生葉；桂花陽生葉Y（NPQ）明顯高于紅葉石楠，但桂花陰生葉則在低光強下稍高于紅葉石楠，在高光強下則稍低于紅葉石楠（見圖3C）。低光強下紅葉石楠陽生葉Y（NO）稍低于桂花，但紅葉石楠陽生葉Y（NO）隨著光強增加而上升且明顯高于桂花陽生葉；紅葉石楠陰生葉Y（NO）未隨著光強的增加而增加，且明顯低于陽生葉；桂花則相反，陽生葉Y（NO）并未隨著光強的上升而變化，但陰生葉Y（NO）則隨著光強的上升而增加，且明顯高于陽生葉（見圖3E）。

光系統Ⅱ光化學反應所利用的能量（Y（Ⅱ））隨光照時間的延長而上升，紅葉石楠陽生葉和陰生葉的Y（Ⅱ）均明顯高于桂花，紅葉石楠陽生葉僅在光誘導初期（100 s）稍高于陰生葉，隨后則與陰生葉無明顯差異；而桂花陽生葉Y（Ⅱ）明顯高于陰生葉（見圖3B）。光系統Ⅱ調節性能量耗散（Y（NPQ））在誘導初期（60 s）即可受光誘導而迅速上升，且桂花葉片Y（NPQ）高于紅葉石楠，但相同樹種的陽生葉和陰生葉間無明顯差異；然而，隨后隨著光照時間延長，紅葉石楠陰生葉表現出比陽生葉更高的Y（NPQ），而桂花則表現為陽生葉Y（NPQ）明顯高于陰生葉，并且桂花陽生葉Y（NPQ）明顯高于紅葉石楠（見圖3D）。光系統PSⅡ非調節性的能量耗散（Y（NO））則表現為隨著光照時間的延長而迅速下降，且紅葉石楠和桂花陽生葉間的Y（NO）無差異，但光誘導后期紅葉石楠陰生葉Y（NO）稍低于陽生葉，而桂花陰生葉Y（NO）則明顯高于陽生葉（見圖3F）。

2.3 光合電子傳遞速率的比較

葉片PSⅡ光合電子傳遞速率的快速光曲線和誘導曲線如圖4所示。在各測量光強下，紅葉石楠陽生葉和陰生葉的ETR均明顯高于桂花，但紅葉石楠陽生葉和陰生葉間ETR無明顯差異，而在較高光強下桂花陽生葉ETR高于陰生葉（見圖4A）。光系統Ⅱ光合電子傳遞速率（ETR）隨光照時間的延長而上升，紅葉石楠陽生葉和陰生葉的ETR均明顯高于桂花；紅葉石楠陽生葉僅在光誘導初期（100 s）稍高于陰生葉，隨后則與陰生葉無明顯差異，而桂花陽生葉ETR明顯高于陰生葉（見圖4B）。對ETR快速光曲線的擬合結果表明，紅葉石楠陽生葉和陰生葉的Jmax和PARsat均顯著高于桂花，且兩種樹種陽生葉的Jmax和PARsat均高于陰生葉（見表1）。

2.4 捕光色素分子內稟特性的比較

由表1可知：越冬期紅葉石楠陽生葉葉綠素含量和N0為陰生葉的1.7倍，而桂花陽生葉則為陰生葉的61.3%，且紅葉石楠陽生葉高于桂花陽生葉。本征光能吸收截面（σik）則表現為紅葉石楠陽生葉低于陰生葉，而桂花陽生葉則高于陰生葉，但紅葉石楠和桂花陽生葉間無明顯差異。處于激發態的捕光色素分子最小平均壽命（τmin）則相反，表現為紅葉石楠陽生葉高于陰生葉，而桂花則陰生葉高于陽生葉，且紅葉石楠顯著低于桂花。

表1 越冬期紅葉石楠和桂花葉片的葉綠素含量、最大光合電子傳遞速率(Jmax)、飽和光強(PARsat)和捕光色素分子物理參數Table 1 Chlorophyll content，maximum photosynthetic electron flow（Jmax），maximum irradiance（PARsat）and physicalparameters of light-harvesting pigment molecules in leaves of P.×fraseri and O.fragrans during overwintering

兩種常綠植物葉片σ′ik和Nk的快速光曲線如圖5 所示。有效光能吸收截面（σ′ik）均隨光強的增加而非線性下降，弱光下紅葉石楠和桂花陽生葉的σ′ik沒有差異，但隨著光強的增加桂花陽生葉的σ′ik下降幅度大于紅葉石楠，并且在各光照強度下，紅葉石楠陰生葉σ′ik均高于陽生葉（見圖5A）。處于激發態的捕光色素分子數（NK）則隨著光強的增加而非線性增加。紅葉石楠和桂花陽生葉的NK沒有明顯差異，但紅葉石楠陰生葉NK低于陽生葉，而桂花陰生葉NK則顯著高于陽生葉（見圖5B）。

3 討論

在未受脅迫的情況下，Fv/Fm一般為0.80～0.85［2］，Fv/Fm的降低則表示植物受到光抑制［20］。PSⅡ的潛在光化學效率（Fv/Fo）則與有活性的反應中心數量成正比關系［21］。我們的試驗結果表明，越冬期低溫脅迫并未引起紅葉石楠葉片光抑制，對于桂花而言，也只有在低溫強光協同作用下才造成葉片輕微光抑制的發生。并且，無論是全光照還是陰生環境，紅葉石楠葉片有活性的反應中心數量均高于桂花，具有比桂花葉片更強的光化學效率（見圖1：A～B）。這表明無論是全光照還是陰生環境下，紅葉石楠對冬季低溫的耐性均高于桂花，且具有更高的光化學效率。

植物可通過減少光能的吸收來防御光抑制的發生。植物葉片對光能的吸收既取決于葉片中葉綠素分子的數量，也取決于捕光色素分子的光能吸收能力［22］。我們的研究表明，紅葉石楠陽生葉的葉綠素含量和葉綠素分子數量明顯高于其陰生葉，而桂花陽生葉則低于其陰生葉（見表1）。這表明，全光照環境下紅葉石楠陽生葉并未通過降低葉綠素含量來減少光能的吸收，而桂花陽生葉則是通過減少葉綠素含量以減少對光能的吸收。捕光色素分子內稟特性決定了光能的吸收與傳遞［3，23～24］。捕光色素分子的光能吸收截面代表了其對光能的吸收能力，其中本征光能吸收截面（σik）代表了捕光色素分子的潛在光能吸收能力，而有效光能吸收截面（σ'ik）則表示捕光色素分子在不同光強下的實際光能吸收能力［18，25］。紅葉石楠陽生葉σik和σ'ik顯著低于陰生葉，而桂花則相反，其陽生葉σik和σ'ik均高于陰生葉（見表1，圖5A），這說明冬季低溫強光降低了紅葉石楠陽生葉捕光色素分子的潛在和實際光能吸收能力。由此可見，紅葉石楠陽生葉主要通過降低捕光色素分子的光能吸收能力。然而，由于捕光色素分子的σik、σ'ik可以隨著溫度變化而快速增加，因此有利于溫度回升后紅葉石楠陽生葉對光能的吸收與轉換。同時，我們也觀察到紅葉石楠和桂花陽生葉的σik并沒有差異，但隨著光響應曲線光強的增強，紅葉石楠陽生葉的σ′ik明顯高于桂花陽生葉（見圖5A）。這意味著全光照環境下兩樹種捕光色素分子的潛在光能吸收能力并無差異，但紅葉石楠陽生葉捕光色素分子的實際光能吸收能力高于桂花陽生葉。

捕光色素分子吸收光能后從基態躍遷到激發態，如果過多的捕光色素分子處于激發態且不能及時通過光化學反應、熱耗散和熒光退激發，將會對植物產生光抑制傷害［10，26］。本實驗結果表明，各測量光強下紅葉石楠陽生葉處于最低激發態的捕光色素分子數（NK）顯著高于陰生葉，桂花陽生葉NK則顯著低于陰生葉（見圖5B）。并且紅葉石楠陽生葉處于激發態的捕光色素分子最小平均壽命（τmin）高于陰生葉，而桂花陽生葉τmin則顯著低于陰生葉，但紅葉石楠陽生葉和陰生葉的τmin均顯著高于桂花（見表1）。這意味著相對桂花陽生葉而言，紅葉石楠陽生葉捕光色素分子吸收光能后能夠快速轉換，并將激發能傳遞給光系統并通過光化學反應等途徑退激發，從而有利于減輕強光對葉片光抑制傷害的風險。事實上，通過比較紅葉石楠和桂花Y（Ⅱ）、qP和ETR快速光曲線和誘導曲線，以及Jmax和PARsat也可得出類似結論。紅葉石楠陽生葉的Y（Ⅱ）、qP和ETR顯著高于桂花（見圖2A，C；圖3A～B；圖4A～B），說明低溫強光下紅葉石楠保持了較高的光化學能力和光合電子傳遞速率。而Jmax和PARsat分別代表了葉片潛在的最大光合電子傳遞速率和飽和光強［18］。桂花陽生葉的Jmax和PARsat均顯著低于紅葉石楠（見表1），也表明桂花葉片對強光的利用能力顯著低于紅葉石楠。這可能是冬季的紅葉石楠仍保持有較強的光合作用和生長能力的原因。

葉片熱耗散能力的增強是植物防御光抑制的另一個重要途徑，NPQ反映了PSⅡ天線色素吸收光能通過熱的形式耗散［27-30］。我們的研究結果表明，無論是NPQ快速光曲線還是誘導曲線，紅葉石楠陽生葉NPQ均顯著低于陰生葉，而桂花則相反，其陽生葉NPQ顯著高于陰生葉（見圖2B，D），兩樹種Y（NPQ）快速光曲線和誘導曲線也表現出相同的趨勢（見圖3C，D）。這表明桂花陽生葉主要是通過熱耗散能力的增強來防御冬季，而熱耗散途徑可能并不是紅葉石楠防御冬季低溫強光的最優光保護策略。

綜上所述：紅葉石楠和桂花均能夠適應亞熱帶地區冬季低溫強光環境，但兩樹種采取了不同的光保護策略。全光照環境下，紅葉石楠主要是通過降低捕光色素分子的實際光能吸收能力以減少光能的吸收，并維持相對較高的光化學能力和電子傳遞速率，從而保護光合機構免受低溫強光傷害；但紅葉石楠陽生葉保持了相對較高的葉綠素含量和光化學效率，這有利于溫度回升后紅葉石楠陽生葉快速轉換到以光化學反應為主并促進光合碳同化的進行。而桂花則主要采用減少葉綠素含量，以及增強熱耗散能力等逆轉速度相對較慢的保護策略為主。這也可能是亞熱帶地區紅葉石楠冬季仍保持生長，而桂花停滯生長的主要原因。